大腸桿菌化轉、電轉感受態細胞的製備

菌液od值是什麼意思

帶有外源 DNA 的重組質粒，在體外構建後，匯入宿主細胞，隨著細胞的大量複製、繁殖，才能夠有機會獲得純的重組質粒 DNA，該過程稱之為轉化過程。

準備工作：

從 LB平板上挑取新活化的單菌落（圓形，直徑 2～3 mm），接種到5mL LB液體培養基中，37℃過夜培養到對數後期。該菌液作為種子培養基進行二次接種。取1mL過夜培養液，接入100ml LB （或SOB）液體培養基中。 37°C，220rpm，振搖2-4小時，每半小時測一次OD，當OD值達到0。5~0。7之間時，停止培養。

化轉感受態的製備

原理

受體細胞經過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化學試劑）的處理後，細胞膜的通透性發生變化，能容許外源 DNA 的載體分子透過。

實驗步驟

1。取1mL過夜培養液，接入100ml LB （或SOB）液體培養基中。 37°C，220rpm，振搖2-4小時，每半小時測一次OD，當OD值達到0。5~0。7之間時，停止培養。

2。將培養液轉入預滅菌的離心管中，冰上放置10分鐘，然後於4℃下4000rpm離心7分鐘。

3。棄去上清，在沉澱的菌種中加入15ml的Tfb1緩衝液重懸細菌（用移液器輕輕吹吸），冰上冷卻一段時間（BL21 DE3 30min；DH5α 10min）後，4℃下4000rpm離心5分鐘。

4。棄去上清，加入2mlTfb2緩衝液重懸細菌，冰上放置幾分鐘，即成感受態細胞懸液。

5。感受態細胞分裝成100μl的小份，此時，可以用新鮮製備的感受態細胞直接做轉化實驗，也可以將細胞在液氮中快速冷凍後，於-80°C冰箱中長期儲存。

6。檢測轉化效率：取100uL新鮮製備的感受態細胞，加入1ng已知濃度的質粒DNA，冰上孵育後進行42℃熱擊，冰上冷卻2min後將細菌重懸在900uL LB（或SOC）培養液，培養45min-1h復甦細菌，分別取10uL和100uL塗板，估計轉化效率。

電轉感受態的製備

原理

電擊法不需要預先誘導細菌的感受態，依靠短暫的電擊，促使DNA進入細菌，轉化率最高能達到10^9~10^10轉化子/ug閉環DNA。因操作簡單，越來越為生物科研工作者所接受。

實驗步驟

1。取1mL過夜培養液，接入100ml LB （或SOB）液體培養基中。 37°C，220rpm，振搖2-4小時，每半小時測一次OD，當OD值達到0。5~0。7之間時，停止培養。

2。將菌液在冰上預冷30分鐘。同時，開啟離心機，預冷至4°C。

3。隨後將菌液分裝到50ml 預冷的離心管中，4°C，4000rpm離心10 分鐘。

4。棄上清液，先用35ml滅菌的Milli Q H2O重懸沉澱的細胞團（用移液器輕輕吹吸），注意低溫。4°C，4000rpm離心12鍾。

5。棄上清液，重複步驟4；

6。棄上清，往離心管中加入少量 10%甘油（滅菌，預冷），重懸菌體，再加10%甘油至終體積約為20ml。 4°C， 4000rpm， 離心10min。

7。小心棄去上清（沉澱可能會很鬆散），最後用 10%甘油（滅菌，預冷）重懸浮細胞，濃縮100倍（100mL菌液最終懸浮在1mL 10%甘油中）。

8。將懸浮菌液以50ul/管分裝於1。5ml的離心管中，此時，可以用新鮮製備的感受態細胞直接做轉化實驗，也可以將細胞在液氮中快速冷凍後，於-80°C冰箱中長期儲存。

9。檢測轉化效率：取50uL新鮮製備的感受態細胞，加入0。01ng DNA，輕輕混合均勻，0。2cm的電擊杯，2。5KV，5ms（0。1cm的電擊杯，1。7KV，5ms）。電轉化後，立即將細菌重懸在950uL LB（或SOC）培養液，培養45min-1h復甦細菌，分別取10uL（1%）和100uL（10%）塗板，估計轉化效率。

轉化效率

轉化效率定義為每1ug的DNA轉化過後可形成菌落的數量，如塗板的100uL菌液裡含有0。001ng的質粒，結果板上長出200個克隆，則轉化效率為：

200 cfu/0。001ng = 2×108cfu/μg

一般轉化效率1×10^6cfu/μg DNA可滿足普通的亞克隆實驗；1×10^7cfu/μg DNA用於作更復雜的亞克隆，有限量的DNA的轉化，T-克隆實驗；構建文庫和突變要求用的轉化的效率為>1×10^8cfu/μg DNA