「技術前沿」單個哺乳動物細胞中高階染色質結構的超解析度成像

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研究介紹

真核細胞透過一種分級的DNA-蛋白質組裝壓縮方式，將長達2米的基因組DNA包裝在一個直徑為幾微米的細胞核中。第一級是核小體，由147 bp的DNA包裹在四個核心組蛋白（H2A、H2B、H3和H4）構成的八聚體上組成。然後，核小體的這個基本重複單元被組織成 10 奈米的“串珠”染色質纖維，進一步壓縮成更高階的染色質結構，以適應微米大小的細胞核。染色質的組織受到大量化學修飾的調控，特別是在組蛋白核心蛋白的N端尾部，如乙醯化和甲基化。組蛋白修飾調節核小體包裝成高階染色質結構，以影響基因組DNA對轉錄機制蛋白的可及性。隨後，不同表觀基因組狀態下的染色質壓縮控制著它們的基因表達，並對許多細胞過程產生顯著影響，如DNA複製、細胞分裂、DNA損傷和DNA修復。

不同的組蛋白修飾如何在每個表觀基因組狀態下塑造高階染色質結構仍然是一個重要的問題。由於傳統光學顯微鏡的解析度有限，目前對不同組蛋白修飾定義的高階染色質結構的理解是透過體外生化分析間接推斷出來的，如染色質免疫沉澱（ChIP）。這些分析通常依賴於對來自聚集細胞群的片段DNA的分析，並在單細胞水平上丟失資訊。目前，超解析度熒光顯微鏡的最新進展使在固定細胞和活細胞中進行低於衍射有限解析度的染色質結構成像成為可能。基於定位的超解析度顯微鏡，如（直接）隨機光學重建顯微鏡（STORM）提供了一種最佳的空間解析度，直接視覺化以前不可見的高階染色質結構甚至光學解析度20-30奈米的體內單細胞核。超解析度成像顯示，體內染色質結構由異質的核小體簇組成，以及特定基因位點不同表觀基因組狀態的不同染色質包裝。然而，由不同的組蛋白修飾形成的原位全基因組的高階染色質結構仍然難以捉摸。

研究關注由組蛋白乙醯化和甲基化標記定義的全基因組高階染色質結構的全面原位特徵，以及它們的空間鄰近性，透過STORM共同形成單個哺乳動物細胞核的染色質環境。我們選擇了一組10個組蛋白標記，包括參與活性轉錄的賴氨酸乙醯化和參與抑制和活躍轉錄的賴氨酸甲基化。研究的超解析度成像和定量分析揭示了高階染色質的三個主要結構特徵：組蛋白乙醯化形成空間分離的核小體奈米團簇，活性組蛋白甲基化形成空間分散的核小體奈米域，抑制性組蛋白甲基化形成高度濃縮的大聚集體。雙色STORM成像顯示，轉錄活性組蛋白標記與“開放”染色質一致，轉錄抑制組蛋白標記與高度濃縮的染色質一致。進一步對它們的空間鄰近性的研究表明，抑制性和活性組蛋白標記大多具有空間排他性，而在活性組蛋白標記中可以觀察到相當多的共定位。綜上所述，超解析度成像有助於揭示組蛋白乙醯化和甲基化是如何在單個哺乳動物細胞核的水平上，在從幾十奈米到幾微米的尺度上形成高階染色質結構的。

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研究結果（節選）

1、不同組蛋白標記的STORM影象和定量表徵

作者可視化了由哺乳動物細胞核中10個組蛋白修飾所定義的全基因組高階染色質結構。圖1A-1C顯示了來自10個組蛋白標記的代表性寬場和超解析度影象，包括轉錄活性組蛋白乙醯化標記（H3K9ac、H3K27ac、H3ac和H4ac）、轉錄活性組蛋白甲基化標記（H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3和H3K36me3）和轉錄抑制組蛋白甲基化標記（H3K27me3和H3K9me3）。圖1A和1B的超解析度影象顯示了明顯的結構特徵：組蛋白乙醯化標記形成空間分離和離散的核小體奈米團簇，和組蛋白甲基化標記形成高度異質和空間分散的核小體奈米域。圖1C的寬視場影象中顯示了抑制標記（H3K27me3和H3K9me3）在細胞核內呈濃縮的聚集物。超解析度的影象清楚地顯示了在核、核仁和核漿外圍的高度濃縮（幾百奈米）中，有甚至是超大（微米大小）團核的存在。圖1D顯示了圖1A-1C中選定的超解析度影象區域中三個代表性組蛋白標記（H3K9ac、H3K4me1和H3K27me3）的總體分佈圖，它清楚地顯示了高階染色質結構的三個明顯特徵。

作者量化了每個組蛋白標記所形成的這些結構特徵。圖1E顯示，組蛋白乙醯化標記在小於50 nm的短長度尺度上表現出狹窄的尖峰，表明存在高度聚集的小奈米結構；組蛋白甲基化標記的RDF分佈更廣，表明存在更大的聚物和更長的相關長度。進一步量化由不同組蛋白標記形成的奈米團簇和奈米結構域的大小，圖1F顯示了平均大小與SD的散點圖。

圖1

2、間期細胞核中不同組蛋白標記和 DNA 的雙色STORM影象

作者透過雙色STORM成像觀測到組蛋白標記和DNA之間的空間關係。圖 2 顯示了轉錄活性或抑制性組蛋白標記（綠色，用 Cy3B 標記）和 DNA（紅色，用 Alexa Fluor 647 標記）的代表性超解析度影象，以及它們的合併影象和共定位點（用白色標記 ）。這些影象顯示，DNA在細胞核中高度緊湊形成了分隔區域，其中，H3K9ac或H3K4me3的活性組蛋白標記在DNA較不致密的區域更為豐富（圖2A和2B），而H3K27me3的抑制性組蛋白標記大多與DNA的濃縮區域相一致（圖2C）。這一直接的視覺證據顯示了組蛋白標記和染色質緻密度之間的關係：抑制性組蛋白標記與高度濃縮的染色質結構有關，而活性組蛋白標記與更多的“開放”或更少緻密的染色質結構有關。

圖2

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研究總結

作者展示了超解析度定位顯微鏡STORM在間期哺乳動物細胞核中的表觀基因組狀態下直接視覺化全基因組高階染色質結構的潛力。研究結果揭示了由組蛋白乙醯化和甲基化標記形成的高階染色質結構的先前看不見的獨特特徵。這一結果為未來研究這些結構特徵的功能意義以及它們在不同疾病狀態下如何改變奠定了基礎。

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超高解析度顯微成像系統

iSTORM

前文中提及的STORM成像技術，目前已成功實現商用，有需要STORM成像技術進行實驗研究的專家老師們，請溝通預約哦~

超高解析度顯微成像系統 iSTORM，成功實現了光學顯微鏡對衍射極限的突破，使得在 20 nm的解析度尺度上從事生物大分子的單分子定位與計數、亞細胞及超分子結構解析、生物大分子生物動力學等的研究成為現實，從而給生命科學、醫學等領域帶來重大性突破

。

圖2、超高解析度顯微成像系統iSTORM。

超高解析度顯微成像系統 iSTORM 具有 20 nm超高解析度、3通道同時成像、3D同步拍攝、實時重構、2小時新手掌握等特點，已實現活細胞單分子定位與計數，並提供熒光染料選擇、樣本製備、成像服務與實驗方案整體解決方案，

以奈米級觀測精度、高穩定性、廣泛環境適用、快速成像、簡易操作等優異特

性，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認可。

參考文獻：

Xu J ， Ma H ， Jin J ， et al。 Super-Resolution Imaging of Higher-Order Chromatin Structures at Different Epigenomic States in Single Mammalian Cells［J］。 Cell Reports， 2018， 24（4）：873。