酵母建庫及篩庫怎麼做？

為了研究某種蛋白與哪些蛋白有相互作用，酵母文庫就誕生了。所謂的“庫”，顧名思義就是“倉庫”，也就是包含所有基因的一個大倉庫。我們透過提取被研究物種的總RNA，再分離出mRNA，透過逆轉錄得到cDNA，之後我們將這些cDNA與AD載體連線，得到了一個AD文庫，再將其轉入酵母中，理論上，這樣的酵母庫能夠表達被研究物種的所有蛋白。

背景說明

提到酵母文庫不得不提到酵母雙雜。酵母轉錄因子GAL4包含有兩個彼此作用但是空間上分離的結構域。一個是DNA結合結構域（DNA-binding domain，BD），另一個則是轉錄啟用結構域（Activating domain，AD）。當兩個結構域充分接近的時候則呈現完整的GAL4轉錄因子活性，並可以啟用下游的報告基因。因此可以將想要研究的兩個蛋白分別連在含有AD與BD的載體上，之後轉染酵母。如果這兩個蛋白相互作用，則會使AD和BD在空間上相遇，從而啟用下游的報告基因。但這種方法只能研究兩個特定蛋白的相互作用。

為了研究某種蛋白與哪些蛋白有相互作用，酵母文庫就誕生了。所謂的“庫”，顧名思義就是“倉庫”，也就是包含所有基因的一個大倉庫。我們透過提取被研究物種的總RNA，再分離出mRNA，透過逆轉錄得到cDNA，之後我們將這些cDNA與AD載體連線，得到了一個AD文庫，再將其轉入酵母中，理論上，這樣的酵母庫能夠表達被研究物種的所有蛋白。

文庫構建方法

我司目前主要使用Gateway技術進行酵母文庫構建。其原理如下：

服務流程

實驗流程

1、客戶樣品QC，total RNA提取（也可由客戶直接提供total RNA）

2、利用磁珠分選進行mRNA分離

3、以mRNA為模板使用進行第一鏈cDNA合成

4、第二鏈cDNA合成

5、三框接頭連線

6、使用磁珠分選進行cDNA分級分離高效去除小片段

7、BP重組構建初級文庫並電轉化DH10B大腸桿菌

8、初級文庫質量檢測

9、LR重組構建次級文庫並電轉化DH10B大腸桿菌

10、次級文庫質量檢測

服務內容及說明

專案週期

35個工作日

酵母單/雙雜文庫構建

結題標準

1、原始文庫容量大於5*10^6 CFU

2、平均插入片段大於1200 bp

3、克隆陽性率大於95%

酵母文庫交付結果

1、酵母單/雙雜交文庫大腸桿菌甘油菌：1mL/管

2、酵母單/雙雜交文庫質粒：大於400g

2、酵母單/雙雜交文庫實驗報告

3、酵母單/雙雜交文庫實驗圖片

酵母單/雙雜文庫篩選結題標準

篩選出和誘餌基因相互作用的陽性菌落，並且完成陽性克隆的PCR測序

酵母篩庫交付結果

1、重組載體的全序列資訊和註釋資訊；

2、重組載體的酶切圖譜；

3、重組載體的測序結果；

4、重組載體：一份質粒、一份大腸桿菌菌液（25%甘油菌）；

（上述4點是客戶需要構建載體。）

5、實驗圖片；

6、實驗報告

7、陽性克隆測序結果

8、轉驗證獵物質粒（選擇迴轉驗證服務才會提供）

材料要求

針對每個文庫，客戶需提供至少能提取500 μg總RNA的新鮮樣本，或者至少500 μg的高質量總RNA。具體要求如下：

酵母建庫技術服務樣品接收標準

客戶下單及專案資訊填寫

1。客戶按照提示填寫專案名稱、選擇專案型別、填寫個人資訊及聯絡方式進行提交；

2。提交專案所需要的具體資訊，包括：

（1）已知的材料品種與組織資訊；

（2）文庫構建型別（核文庫/膜文庫）；

（3）如果有特殊要求請在備註中註明

3。文庫構建材料：用於提取total RNA的組織材料或者已提取好的total RNA；

實驗資訊

實驗過程中客戶可以隨時登入管理系統檢視專案實時進展情況。實驗結題時90系統會透過簡訊自動通知客戶，併發送實驗報告檢視地址。實驗結題後，實驗報告，檢測結果可線上檢視或列印，並永久保留。

文獻舉例

相關實驗結果案例展示

1、 total RNA提取結果：

2、 mRNA純化

3、 初級文庫片段長度與陽性率驗證

初級文庫：長度範圍300－3000bp，平均長度>1200bp，陽性率100%

4、次級文庫片段長度與陽性率驗證

次級文庫：長度範圍：650-3000bp，平均長度>1200bp，陽性率100%