微生物學報：結合三代測序與二代測序技術揭示蜜蜂球囊菌孢子轉錄組的複雜性

標題

結合三代測序與二代測序技術揭示蜜蜂球囊菌孢子轉錄組的複雜性

作者

孫明會，劉佳美，王思懿，朱樂冉，王紫馨，葉亞萍，錢加珺，顧小雨，徐細建，陳大福，郭睿，徐國鈞

摘要

【目的】蜜蜂球囊菌（

Ascosphaera apis

）是一種專性侵染蜜蜂幼蟲的致死性真菌病原。本研究旨在利用PacBio單分子實時（single molecule real-time，SMRT）測序技術對蜜蜂球囊菌孢子（AaS）中基因的可變剪下（alternative splicing，AS）和可變多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，APA）以及長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA）進行鑑定和分析，進而揭示蜜蜂球囊菌孢子中轉錄組的複雜性。【方法】採用Suppa軟體對蜜蜂球囊菌孢子中基因的AS事件進行鑑定。透過RT-PCR對不同型別的AS事件進行驗證。採用TAPIS pipeline對蜜蜂球囊菌孢子基因的APA位點進行鑑定。利用MEME軟體分析孢子全長轉錄本的poly（A）剪接位點上游50 bp的序列特徵並鑑定motif。聯用CPC和CNCI軟體和比對Swiss-prot資料庫的方法預測lncRNA，取三者的交集作為高可信度的lncRNA集合。進一步比較lncRNA和mRNA的轉錄本長度，外顯子數量與長度，內含子長度，GC含量，AS事件數量。【結果】在蜜蜂球囊菌孢子中共鑑定到2 609次AS事件，包括1227次（47。03%）內含子保留（retained intron，RI），842次（32。27%）可變3剪下（alternative 3 splice sites，A3），415次（15。91%）可變5剪下（alternative 5 splice sites，A5），85次（3。26%）可變起始外顯子（alternative first exons，AF），35次（1。34%）外顯子跳躍（skipping exon，SE），4次（0。15%）可變末端外顯子（alternative last exons，AL）和1次（0。04%）互斥外顯子（mutually exclusive exons，MX）。透過RT-PCR證實了不同型別AS事件（RI、A5、SE和A3）的可靠性。共鑑定出5552個基因含APA位點，其中含有>5個APA位點的基因數量最多，達到2197個，其次為含有1個APA位點的基因，數量為1149個；此外，含有2、3、4和5個APA位點的基因數量分別為782、596、477和351個。蜜蜂球囊菌孢子中全長轉錄本的上下游序列具有明顯的鹼基傾向性，U和A分別在轉錄本的下游和上游富集。共鑑定到953條lncRNA。與mRNA相比，上述lncRNA的外顯子數量更少且長度更短，內含子長度更短，轉錄本長度更短，GC含量更低，AS事件數量更少。【結論】本研究全面解析了AaS中的AS、APA和lncRNA，研究結果豐富了蜜蜂球囊菌的基礎生物學資訊，深入揭示了蜜蜂球囊菌孢子中轉錄組的複雜性，併為進一步探究不同剪接異構體在病原孢子和病原侵染中的分子功能打下了基礎。

圖片摘要

圖

1

蜜蜂球囊菌孢子基因中

剪接異構體的

IGV

瀏覽器檢視

圖

2

蜜蜂球囊菌孢子中

5

個基因的

AS

事件的

RT-PCR

驗證

圖

3

蜜蜂球囊菌孢子中基因的

APA

位點數量和上下游序列特徵

圖

4

蜜蜂球囊菌孢子中全長轉錄本的

APA

位點上游

50 nt

位置鑑定到的

4

個

motif

圖

5

蜜蜂球囊菌孢子中

lncRNA

的數量和型別

圖

6

蜜蜂球囊菌孢子中

lncRNA

與

mRNA

的結構特徵比較

原文連結：

https：//actamicro。ijournals。cn/html/actamicrocn/2022/8/20220810。htm