專家點評｜新型熒光探針用於檢測內源大麻素的時空動態變化

點評 | 劉志傑

（上海科技大學）

、李曉明

（浙江大學）

、Pablo Castillo

（Albert Einstein College of Medicine）

責編 | 兮

人類歷史上，大麻已被馴化並使用了數千年。完成於漢代的中國最古老的藥書《神農本草經》中記載：“麻蕡（即大麻果實），味辛平。主五勞七傷，利五臟，下血，寒氣。多食，令人見鬼，狂走。久服，通神明，輕身”，這不僅介紹了大麻的藥學功效，還描述了人攝入大麻所引發的幻覺等精神活動的變化。現在人們已經知道，古書上所記載的大麻對人精神活動的影響是由其天然成分大麻素類分子進入人體後作用在內源大麻素系統而實現的。

圖一：大麻形態示意

內源大麻素（endocannabinoids， eCBs），包括花生四烯酸甘油酯（2-Arachidonoylgylcerol，簡稱2-AG）和花生四烯酸乙醇胺（N-arachidonoylethanolamide，簡稱AEA），是由神經元合成和釋放的一類脂類神經調質分子。經典神經遞質從突觸前末梢釋放，啟用突觸後膜受體；而eCB“反其道而行之”——在突觸後神經元釋放，逆行性地作用在特定型別神經元突觸前膜大麻素受體CB1R（Cannabinoid receptor type 1）上，發揮突觸前抑制作用。近二十年來的研究發現，eCB參與大腦多個腦區，包括皮層、海馬、紋狀體、杏仁核、下丘腦和黑質等，的突觸可塑性調節，對維持神經系統的正常功能至關重要，與獎賞行為、能量代謝、學習記憶、睡眠覺醒、情緒等多種生理過程密切相關。內源大麻素系統的調控異常也與神經退行性疾病、癲癇、成癮、抑鬱症和精神分裂症等諸多神經疾病和精神類疾病密切相關。然而，

目前缺乏高靈敏度、高時空解析度的實驗手段直接檢測在體eCB的動態變化

，極大地限制了人們對其在生理和病理狀態下重要功能和分子調控機理的研究。

2021年11月11日，北京大學

李毓龍

實驗室在

Nature Biotechnology

雜誌線上發表了題為

A fluorescent sensor for spatiotemporally resolved imaging of endocannabinoid dynamics in vivo

的研究論文，

報道了新型基因編碼的內源大麻素探針GRABeCB2.0的開發和在體內外多種場景下的應用

。李毓龍實驗室自2018年以來，先後開發了針對乙醯膽鹼、多巴胺、去甲腎上腺素、腺苷、五羥色胺等神經遞質/調質的熒光探針，此次發表的GRABeCB2。0是其又一力作，進一步擴充套件了GRAB系列熒光探針家族。

在這一工作中，李毓龍實驗室運用其先前設計的GRAB探針策略 （GPCR activation-based sensor），基於人源大麻素受體CB1R和迴圈重排的綠色熒光蛋白cpEGFP開發了eCB探針eCB2。0。在體外培養的HEK293T細胞和原代神經元中，eCB2。0探針均表現出良好的細胞膜定位，對外源加入的大麻素AEA和2-AG有亞微摩至微摩級的親和度，秒級的動力學響應和高度的分子特異性

（圖二）

。此外，eCB2。0探針不會啟用GPCR下游訊號通路，表明探針本身對細胞的正常生理活動沒有明顯影響。

圖二：eCB2。0在HEK293T細胞和原代神經元上的表現

那麼，eCB2。0能否用來檢測神經元釋放的eCB？作者先從體外培養的原代神經元入手，證明eCB2。0能夠檢測到電刺激引發的來自神經元的eCB釋放。透過藥理學方法，作者發現此時神經元釋放的eCB型別主要為2-AG。此外，作者還發現，即使不給予電刺激，也能記錄到離散分佈的直徑約為10微米的自發性eCB2。0訊號，表明eCB的釋放具有特異和區域性的特性。在急性腦片這一更接近生理條件的體系中，電刺激和高鉀溶液刺激均能引起eCB的釋放，其區域性釋放的特點也再次被驗證：eCB2。0能夠以單個軸突扣結（bouton），即

單個突觸的空間解析度

，檢測到海馬體CB1R陽性神經元上的eCB訊號。

基底外側杏仁核（basolateral amygdala， BLA）是介導恐懼反應和加工厭惡記憶的關鍵腦區。內源大麻素受體CB1R在此處有高水平的表達。為了研究活體動物在受到傷害刺激時BLA腦區處的eCB動態變化，作者藉助AAV病毒在小鼠BLA表達eCB2。0探針並使用光纖記錄的手段成功檢測到給予小鼠足部電擊時的BLA腦區中eCB的訊號。另一方面，在海馬體CA1腦區，作者使用活體雙光子雙色顯微成像的方式，記錄了小鼠跑步時CA1區神經元的鈣訊號和eCB訊號，發現跑步行為總是伴隨著CA1神經元的興奮以及eCB訊號的上升，表明eCB2。0探針能夠實時檢測小鼠在生理條件下（運動過程中）大腦中內源大麻素的動態變化。

當大腦處於疾病狀態時，eCB的釋放又會呈現什麼樣的變化呢？過去的研究發現，內源大麻素系統受損的動物易發癲癇。為了探究癲癇和eCB訊號的聯絡，作者構建了癲癇模型小鼠，並藉助雙光子成像記錄了小鼠癲癇發作時的神經元活動和eCB動態。有意思的是，當小鼠被誘導發生癲癇時，海馬體CA1區神經元表現出劇烈的鈣訊號活動並伴隨強烈的eCB訊號上升；更有意思的是，緊隨著癲癇發作後，作者在CA1腦區記錄到了沿著水平方向傳遞的強烈的“鈣波”訊號和“eCB波”訊號（見影片）。

影片：小鼠癲癇發作前後的海馬體CA1腦區的內源大麻素訊號和鈣訊號的變化，注意內源大麻素波和鈣波的傳遞

總而言之，在這項工作中，作者

首次實現了對eCB的高時空間解析度記錄，為科學界深入研究內源大麻素在生理和病理條件下的重要功能和調控機理提供了有力的新工具。

值得一提的是，這項研究的合作者美國斯坦福大學Ivan Soltesz實驗室藉助eCB2。0探針就內源大麻素在大腦中的動態及其在癲癇中的作用進行了更進一步的研究，相關成果同期發表在

Neuron

雜誌上。

圖五：Ivan Soltesz實驗室藉助eCB2。0探針解析了活體動物海馬體內源大麻素訊號的分子特性和時空動態。他們發現，相較於正常生理活動時，癲癇引起大量2-AG的釋放，而2-AG為長時程的中風樣症狀提供了基礎底物（Farrell et al， 2021）。

北京大學生命科學聯合中心2021屆博士畢業生

董傲

為本文第一作者，北京大學生命科學學院

李毓龍

教授為通訊作者。清華大學本科畢業生

何凱凱

、北京大學博士研究生

蔡儒儀

、

王歡

、本科畢業生

段佳麗

等對文章做出了重要貢獻。該工作得到了美國國立衛生研究院

David Lovinger

實驗室、美國冷泉港實驗室

Bo Li

實驗室、美國斯坦福大學

Jun Ding

實驗室和

Ivan Soltesz

實驗室等團隊的合作，並得到北京大學膜生物學國家重點實驗室、北大-清華生命科學聯合中心。

更多李毓龍實驗室工作詳見：http：//yulonglilab。org/

專家點評

劉志傑

（上海科技大學教授，大道書院院長，iHuman研究所執行所長）

內源性大麻素系統（ECS）廣泛分佈在神經系統，由內源性大麻素和其作用受體以及負責合成和降解內源性大麻素的酶所組成，在人類發育期到成年期的各個階段都起著至關重要的作用。除了主要的大麻素受體CB1和CB2外，近年來的研究還不斷髮現新的大麻素靶點，在神經系統、免疫系統、心血管系統等處發揮作用。ECS與疼痛、肥胖、成癮、炎症和其他疾病均密切相關，因而該系統的各大重要組分也均是潛在的藥物靶點。

研究ECS離不開合適的工具。然而，受限於技術的匱乏，我們過去無法直接對內源性大麻素進行實時檢測，特別是研究在體情況下內源性大麻素的動態與行為的關係。李毓龍教授多年來專注基於GPCR的熒光探針的開發，已經建立起成員豐富的GRAB探針庫，實現了對多種神經遞質和神經調質分子的檢測。在這項新研究中，GRAB-eCB2。0探針展示出良好的效能，在體外培養的細胞、腦片和活體小鼠上均檢測到穩定的內源性大麻素訊號，為今後解析內源性大麻素在體內的功能開闢了全新的途徑。期待他們在今後開發出更多創新的探針。

專家點評

李曉明

（浙江大學教授，長江學者）

我國是種植和使用大麻最早的國家，早期藥書《神農本草經》及《本草綱目》中就有關於大麻的醫藥和保健用途的大量記載，可用於治療疼痛、癲癇、嘔吐等。除了天然存在的大麻素外，研究發現體內也有合成和分泌大麻素物質，被稱為內源性大麻素（endocannabinoid， eCB），可以調控情緒、睡眠、食慾等神經活動過程。不管是植物大麻中的四氫大麻酚，還是內源性大麻素eCB，都透過作用於人體中的大麻素受體CB1和CB2來實現訊號傳遞，共同構成內源性大麻素系統。與傳統意義上的神經遞質不同的是，內源性大麻素eCB並非合成後儲存在分泌囊泡內，eCB的合成是一種“按需”的方式，只在需要釋放的條件下合成，並立即釋放到突觸間，然後迅速透過再攝取或者酶降解的方式失活。雖然我們對eCB的生物化學及生理學特徵有較多瞭解，但由於技術的限制，有關eCB在生理和病理條件下是何時、何地以及如何被釋放的時空動力學仍不清楚，給eCB系統功能和資訊通路的研究和理解帶來了極大的挑戰。

近日，

Nature Biotechnology

報道了北京大學李毓龍教授團隊自主研發的新型eCB探針——RABeCB2。0。這一新型探針的原理在於，利用人源性大麻素受體CB1作為探針的骨架，並把對結構變化敏感的綠色熒光蛋白（cpEGFP）嵌入受體，改造後的CB1與eCB結合後會引發構象變化，而構象變化則會被轉換為熒光訊號，因此可透過檢測熒光亮度變化來反映eCB水平的變化。在體外培養的細胞和急性小鼠腦片中，GRABeCB2。0被證實具有親和力強、靈敏度高、分子特異性、相應速度快等優點。重要的是，結合eCB探針、遺傳學以及在體光纖記錄等實驗，GRABeCB2。0也能很好的動態實時監測小鼠經足底電擊、運動以及癲癇處理後的腦內杏仁核和海馬eCB水平的變化，表明GRABeCB2。0探針可以被有效地應用於監測活體動物大腦中eCB的“一舉一動”。

李毓龍教授自2012年回國，在北京大學生命科學學院建立自己的實驗室，所領導的團隊是新型神經遞質感受器研發領域的先驅。過去數年間專注於神經元通訊的基本結構突觸上，一方面致力於發展新型遺傳編碼的熒光探針，用於在時間和空間尺度上解析神經系統的複雜功能。另一方面，藉助先進的工具解析生理及病理情況下神經元的通訊連線。近年來他們已自主研發了可在高時空解析度上檢測乙醯膽鹼（

Nature Methods

， 2020；

Nature Biotechnology

， 2018）、多巴胺（

Nature Methods

， 2020；

Cell

， 2018）、去甲腎上腺素（

Neuron

， 2019）、腺苷（

Science

， 2020）、5-羥色胺（

Nature Neuroscience

， 2021）等神經遞質的探針，上述探針已廣泛應用於神經環路功能及遞質釋放調控機理等領域的研究，推動神經遞質類“暗物質”研究進入“視覺化”研究的新時代。

專家點評

Pablo Castillo

（Albert Einstein College of Medicine， Harold and Muriel Block Chair in Neuroscience）

Seeing is believing。 Imagine a molecular sensor that allows you to visualize and characterize the release of an endogenous ligand with a superb spatiotemporal resolution and excellent sensitivity。 Based on G protein-coupled receptors （GPCRs） conjugated with a fluorescent protein， Yulong Li and collaborators have successfully developed fluorescent sensors for visualizing the release of several neurotransmitters and neuromodulators in the brain。 In a new study published in Nature Biotechnology （Dong et al， 2021）， they report a new GPCR activation-based （GRAB） sensor for endocannabinoids （eCBs）， GRAB eCB2。0， which can be used to characterize eCB release both in vitro and in vivo。 Thus far， eCB release has been indirectly estimated by the functional consequences of eCB binding to cannabinoid receptors。 Now， thanks to this new sensor， we can visualize eCB release and address mechanistic questions that will significantly advance our understanding of eCB signaling in the normal brain and in several brain disorders。

俗話說：眼見為實。對分子探針的成像能夠實現對特定內源配體的釋放進行具有超高時空解析度和卓越靈敏度的檢測和刻畫。基於G蛋白偶聯受體和熒光蛋白，李毓龍和合作者們在過去成功開發了數個檢測大腦中神經遞質和神經調質釋放的熒光探針。在這項最新發表在

Nature Biotechnology

（Dong et al， 2021）的工作中，作者們報道了一個新型的基於G蛋白偶聯受體啟用的（GRAB）探針eCB2。0，用於研究體外和體內情況下的內源大麻素釋放。在此之前，內源大麻素的釋放是透過檢測內源大麻素結合大麻素受體的功能性後果來間接指示的。現在，得益於這個新探針，我們能夠直接“看到”內源大麻素並可以嘗試解決一些機制性問題，幫助我們大大加深對內源大麻素訊號在正常大腦和腦疾病中作用的認識。

原文連結：

https://doi.org/10.1038/s41587-021-01074-4