理性設計植物生物酶，提高生物量和光合效率丨換訪河南農業大學王

植物育種是改變植物性狀以產生所需特徵的科學，它已被用於改善人類和動物產品的營養質量，目標是培育出適用於各種農業應用的具有獨特和優越性狀的作物品種，植物育種的關鍵就在於尋找優良基因。

選擇優良基因可以從現有品種、群體和一些野生品系中尋找決定目標性狀的重要基因及其變異，

但植物自然進化幾百萬年也很難產生理想的突變

，因此透過現有的基因工程技術設計改造出原來自然界不存在的、能產生預期性狀的超強蛋白質是一條可以期待的路線。

近日，河南農業大學

王燃

團隊和河南大學棉花生物學國家重點實驗室

苗雨晨

團隊合作，對菸草萜類物質合成的關鍵生物酶開展理性設計，

構建了一整套基於蛋白結構的生物酶理性設計（理性設計：藉助計算機和目前積累的對蛋白結構的認識去嘗試設計改造蛋白質）的技術體系，填補了植物生物酶理性設計工程的研究空白，

相關成果以 “

Rational Design of Geranylgeranyl Diphosphate Synthase Enhances Carotenoid Production and Improves Photosynthetic Efficiency in Nicotiana tabacum

” 為題，發表在

Science Bulletin

上。

（來源：Science Bulletin）

為此，生輝 SynBio 邀請到了王燃博士與我們分享他的研究成果。

2001 年 9 月，王燃在河南大學生物生命科學學院開啟本科階段的學習，專業為生命科學，2005 年 9 月進入中國科學院遺傳與發育生物學研究所進行碩博連讀並獲得博士學位，先在鄭州菸草研究院開展植物基因功能研究工作，現就職於河南農業大學生命科學學院，主要研究方向為植物分子生物學和基因功能。

圖丨王燃（來源：受訪者提供）

理性設計植物生物酶

牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS）是植物萜類物質合成的關鍵蛋白酶，其酶活性決定各個分支萜類物質的含量。

萜類化合物是植物體內數量和結構變化最多的一類代謝物，包括單萜、倍半萜、 二萜、三萜、四萜等各種型別，

廣泛參與植物生長髮育、光合作用、訊號轉導、環境適應及抗逆等各種生理過程，發揮著重要的生物學功能。

異戊烯基焦磷酸（IPP）和烯丙基異構體二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）是萜類化合物生物合成的重要前體，IPP 和 DMAPP 可以在異戊烯基焦磷酸異構酶（IDI）的作用下相互轉化。IPP/DMAPP 可以透過兩個途徑合成， 即位於細胞質中的甲羥戊酸（MVA）途徑和位於植物質體中的甲基赤蘚醇 - 4 - 磷酸（MEP）途徑。

圖 | 植物體內萜類合成途徑（來源：研究論文）

NtGGPPS 是模式植物菸草中 MEP 途徑中的一種關鍵酶，NtGGPPS1 是 NtGGPPS 最重要的家族成員，

純合 NtGGPPS1 突變體葉面積及株高顯著降低，八氫番茄紅素、β- 胡蘿蔔素、葉黃素、新黃質、紫黃質和花葯黃質均顯著減少。

王燃及其團隊將菸草中含有的 NtGGPPS1 酶與底物進行對接，確定酶的活性口袋周圍的 16 個氨基酸位點（圖 a），構建單點飽和突變體庫。透過高通量的細菌顏色實驗進行篩選，獲得 5 個可以顯著提升酶活性的氨基酸位點，並進一步對以上位點進行迭代組合突變獲得酶活性最高的突變體 d-NtGGPPS1（V154A/I161L/F218Y/I209S/V233E）（圖 b）。

圖丨a。 NtGGPPS1 的酶的活性口袋；b。 理性設計的 d-NtGGPPS1 氨基酸位點；c。 轉基因 d-NtGGPPS1 菸草的表型

相對於 NtGGPPS1，理性設計的 d-NtGGPPS1 可以將底物 IPP 和共同底物 DMAPP 轉化為 GGPP 的效率提高約 1995.5 倍，將 GPP 轉化產生 GGPP 的效率提高約 25.9 或 16.7 倍。

將理性設計後的 d-NtGGPPS1 回補到 NtGGPPS1

突變體可以顯著

提高菸草的葉面積、株高及生物量，

顯著提升菸草葉片類

胡蘿蔔素

（八氫番茄紅素、β- 胡蘿蔔素、葉黃素、新黃質、紫黃質和玉米黃質）及

葉綠素

（葉綠素 a 和葉綠素 b）含量，

增強菸草的光合作用效率及抵抗強光逆境脅迫的能力

（圖 c）。

該研究表明理性設計 GGPPS 可以

提升植物的產量和品質性狀，為未來透過理性設計獲得植物優良基因提供新的突破口。

王燃說，“

透過理性設計實現植物的基因改造目前國內較少，而且改造相對較難。

”

他補充道，關鍵難點是建立快速篩選的酶活體系，很多酶的底物目前只能靠儀器檢測比如質譜，肉眼無法觀測到；其次，透過計算機模擬預測酶活中心最關鍵的氨基酸，氨基酸的空間位置任意變化都會改變酶的活性；最後，之前理性設計都是在微生物中驗證，這是第一次在植物中進行探索，蛋白質能否在植物體內預期表達仍是未知。

“完全的理性設計目前還很難實現，於是就產生了結合基因文庫和篩選技術的半理性設計技術，嚴格來說，我們目前所做的研究是半理性設計，屬於理性設計的範疇。”

植物合成生物學或為育種帶來突破

得益於近年來系統生物學和分子生物學等多方面技術的發展，合成生物學的研究物件正逐步過渡到更為複雜的多細胞體系，植物合成生物學正成為合成生物學的 “下一篇章”。

植物擁有豐富的內膜系統和細胞器、高度特化的生物合成基因簇、精細的代謝調控網路，為開展相關研究提供了理想的模式體系。

以植物為底盤的合成生物學研究，如設計檢測環境變化的植物感測器、開發精準修飾的基因編輯技術、建立高效異源合成代謝途徑和生物反應器底盤等，不僅有助於人類加深對複雜生命執行規律的理解，還有望為解決農業生產、生物製藥、能源環境等方面的困境與難題提供新策略，實現可持續發展。

目前最常見的底盤植物是擬南芥，擬南芥由於其植株小、結實多、生命週期短、基因組簡單、遺傳操作簡便，近四十年來由田野裡不起眼的小草成為植物研究領域最耀眼的明星。

圖 | 微笑的擬南芥（來源：中國科學院遺傳與發育生物學研究所）

“菸草是一個非常好的底盤植物，容易轉化和栽培，並且菸草也是中國非常重要的經濟作物。”

圖丨菸草（來源：雲南省菸草農業科學研究院）

王燃表示，植物基因組研究的首要難點在於週期長，譬如小麥，每年十月開始種植，第二年六月收割，就連生長週期較短的擬南芥也最少需要三個月左右的時間；其次對於作物的基因功能整體認識不夠，改造一個基因很難實現預期性狀；另外，植物譬如小麥等等作物基因組較大，基因克隆和定位的過程難度比較大。

他補充道，

雖然研究植物基因組較難，但選擇植物是必須的，否則不能開展育種和技術的有效轉化應用，植物是不會說話、不會表達情緒的，必須透過各種性狀的檢測才能判斷基因是否發揮了功能。

植物合成生物學是一個結合了工程學原理與植物生物學原理以取得設計和產品方面新計劃的新興領域，這個新興領域可以在未來農業中改進傳統作物的方向上起到重要作用，也使得培育新奇的植物生物產品的實現成為可能。

從實驗室走向大田仍需努力

“做植物研究的最終目標是落地，從實驗室到大田需要群體和中間技術去實現，譬如理性設計，設計的基因如果不能開展基因轉化也是不能產生品種的，需要結合其他群體和技術開展品種創制工作，

在推入大田前，需在實驗室嚴格控制作物的生理指標，大田推廣程式較嚴格，從小規模種植到大規模區試再到推廣，必須經歷非常嚴格的週期，

” 王燃告訴生輝 SynBio。

他補充道，“要想從實驗室推廣到大田，研究基礎必須要牢固， 快速並準確的確定靶標及基因功能應用方式，並結合大田生產採用合理的推廣路徑。”

由於大田環境條件多變，目前報道的很多實驗資料來源於實驗室或溫室，缺乏田間資料，因此需加大對田間高通量表型監測平臺的建設力度。

自然環境的大田中鹽鹼、乾旱區域分佈極不均勻，不斷變化的自然條件加上灌溉不當不僅導致大量淡水資源的浪費也使得農業土壤出現一定程度上的退化，導致鹽鹼、乾旱區域不斷增加；目前雖然對每種脅迫單獨存在時如何影響植物的生長髮育瞭解相對較多，但對植物如何協調並適應不同脅迫組合卻知之甚少。

（來源：中科院南皮生態實驗站劉小京）

未來需針對我國乾旱、鹽鹼區域化的特點，建立多個代表性的高通量大田表型檢測平臺，篩選出一批優質耐逆的作物新品系，打通從實驗室到大田的生產應用。

此外，不同作物甚至同一作物的不同品種，對非生物脅迫的響應及其適應機制也不盡相同，但植物為適應惡劣的生存環境，進化後的形態結構通常可以適應多種逆境脅迫。

因此，要對不同作物或同一作物的不同品種的非生物脅迫耐受性的機理， 進行多角度不同方法的全面研究，進而培育出具有廣泛抗脅迫能力的新品種。