「羅工秘籍」流式分析的圈門思路之—先分析淋系還是髓系？

最近一段時間，羅工發現越來越多的老師開始著手進行或者設計多色流式免疫亞群的檢測方案，所以最近幾期會著重和大家聊聊多色流式的圈門分析思路，旨在幫助大家更好的在實驗後完成自己的資料分析，得到更準確的流式結果。

多色流式免疫亞群的檢測是當下的一大趨勢：

一方面，更多的指標讓我們在一份樣本中同時獲取了更多的免疫亞群的比例資訊，減少了我們的實驗工作量，分擔了我們的工作壓力和試劑損耗；

例如下圖：相比兩組完成的流式方案，選擇一組完成的多色方案會更節約CD45和死活染料的試劑，同時減少一半的樣本損耗和大量工作時間：

另一方面，單樣本多指標的檢測有利於我們後續對實驗結果進行更多的演算法分析，例如現在流行的一些降維和聚類分析。

例如下圖，利用降維分析T-sne直接獲得多細胞亞群的視覺化關係：

因此，我們有很多老師會選擇將一些淋巴和髓系的細胞亞群marker同時標記於一個樣本，期望獲得不錯的流式結果，那麼在圈門分析時應該是先圈淋巴亞群，還是先圈髓系呢？

今天羅工就在這裡給大家講講，在同時分析多細胞亞群的流式結果時，個人推薦先圈髓系亞群。理由如下：

1。 髓系亞群的FSC SSC更大，大面積會有更多的非特異性抗體著色，我們會發現一些淋巴亞群的marker在髓繫上也有著細微的非特異性表達，如果直接圈取，等於增加了淋巴亞群的假陽性訊號：

如上圖，我們看到在SSC med-high的位置 均存在CD3/CD56的陽性表達，這是不太符合常規的淋巴細胞位置的，很可能就是髓系細胞的非特異性著色；

2。 髓系亞群的形態更難確定，需要透過biomarker來完成樣本的篩選；

相對而言 CD45high ssclow更容易獲得淋巴細胞的位置，而髓系細胞的位置相對彌散也不夠成群（包含單核+粒細胞群），更需要biomarker的定位來獲得。

綜合如上兩點，我們可以選擇先圈出髓系來排除非特異性結合，再來精準的根據細胞形態&biomarker來圈出淋巴亞群：

對比兩組圈門：

1。 先淋巴，後髓系：

2。 先髓系，後淋巴：

此時淋巴亞群的SSC/淋巴的圖如下，對比直接圈，這樣的非特異性統計就會大大降低了：