纖維蛋白原的製備

背景及概述

纖維蛋白原即凝血因子I（FactorI），是凝血系統“中心”蛋白之一。在所有的凝血因子中纖維蛋白原含量最高；在血漿中其濃度約2~5g/L，是可溶性的糖蛋白，等電點是5。5，沉降常數是7。7~7。9，由肝細胞和巨核細胞合成，見下圖。

纖維蛋白原在體內以溶解狀態存在，經凝血酶作用轉變為纖維蛋白發揮其凝血功能，並參與體內感染、炎症、組織損傷修復等一系列病理、生理過程。纖維蛋白原是凝血過程中的底物，其製劑適用於先天性無或低纖維蛋白原血癥以及纖維蛋白原含量低下而引起的異常出血和需實施手術的病人，外用纖維蛋白原主要被製成纖維蛋白原粉（止血粉）及止血繃帶等用於止血。目前研究報道稱纖維蛋白原與纖維生長因子FGA-2結合能促進內皮細胞的增殖，為纖維蛋白原的應用開闢了新的途徑，近年來纖維蛋白原在醫療應用領域倍受關注，其發展前景甚是廣闊。

圖1 纖維蛋白原多維結構圖

製備

中國具有豐富的豬血資源，但是由於生產工藝條件研究不夠成熟，導致豬血資源的利用率尚不到1%。2006年首次用凍融法提取豬血纖維蛋白原，1L血漿可提得纖維蛋白原2。67g，樣品中纖維蛋白原含量達82。6%，提取率達91。0%。製備的纖維蛋白原樣品中纖維蛋白原含量為84。3%，纖維蛋白原提取率為88%；用凍融法提取分離得到的纖維蛋白原的含量為2。81g/L，其提取率為89。05%；

用冷乙醉沉澱法和離子交換層析法分離纖維蛋白原，纖維蛋白原樣品中纖維蛋白原含量分別為71。1%和68。0%，提取率分別為88。1%和95。0%；用改良冷沉澱法提取纖維蛋白原，與傳統沉澱法比較；改良冷沉澱法得到的纖維蛋白原含量為（196。4±23。3）mg/200mLFFP（新鮮冰凍血漿），而傳統沉澱法得到的纖維蛋白原含量為（184。6±21。7）mg/200mLFFP，這表明改良冷沉澱法比傳統沉澱法的提取率高；用反覆冷沉澱法提取纖維蛋白原，提取所得纖維蛋白原的平均濃度為（54。2±19。9）g/L；考察了四種沉澱方法（冷凍法、乙醇法、聚乙二醇法和硫酸銨沉澱法）對豬血漿中纖維蛋白原分離的影響，認為硫酸銨沉澱法的分離效果最優。

文獻中關於纖維蛋白原提取方法的建立與最佳化的報道甚少，並且關於各個提取方法的優缺點尚未見報道，因此，本研究選擇反覆冷沉澱法、經典冷沉澱法、冷乙醇法、硫酸銨沉澱法和聚乙二醇沉澱法5種提取方法，透過對以上各種提取方法反覆實驗，以單次血液處理量、製備流程耗時、纖維蛋白原的濃度，是否需要新增化學試劑和纖維蛋白原的純度為考察指標，進行對比分析研究，確定最優提取方案，為完善纖維蛋白原提取方法和臨床應用研究提供參考，併為提高豬血資源綜合利用率、減少浪費和環境汙染提供一種新的思路。

提取方法

經典冷沉澱法：取抗凝全血40mL，4℃低溫下，按照2000~4000r/min離心10min。獲得的血漿-80℃深低溫冷凍處理1~6h。4℃下解凍至全部融化即得到纖維蛋白原產物。

反覆冷沉澱法：重複冷沉澱中冷凍與融化步驟2~3次，其餘操作相同。

冷乙醇沉澱法：0℃預凍10%乙醇。與24~32mL血漿充分混合，離心15min取沉澱。

硫酸銨沉澱法：將3~5mL血漿與1mL飽和硫酸銨充分混合，按照3000r/min離心3~15min取沉澱。

聚乙二醇沉澱法（PEG沉澱法）：將4。5mL抗凝血按照2000r/min離心15min，分離並儲存上層血漿。血漿於BaSO4（2。25g）和MgSO4（0。01235g）孵育1h。緩慢倒出上層血漿，加入30%PEG（分子量1000）溶液（枸櫞酸緩衝液，pH7。4），使成10%（W/V）PEG混合液。按照10000r/min離心20min，取沉澱。

以上每種方法重複5次，測定獲得的纖維蛋白原產品的濃度與純度，並對資料進行統計學分析。資料分析纖維蛋白原含量測定採用Jocobsson法、總蛋白濃度測定採用雙縮脲法、提取纖維蛋白原產品的濃度與純度計算方法為：纖維蛋白原濃度ρ/（g/L）=（A280-A315）×稀釋倍數/15。87（式中A280和A315分別為待測的稀釋後纖維蛋白原溶液在280nm和315nm波長的吸光度，15。87為纖維蛋白原在鹼性條件下280nm的吸光係數）；纖維蛋白原純度=纖維蛋白原濃度/總蛋白濃度×100%。對測定的資料使用統計軟體SPSS18。0進行統計學處理，計量資料以平均數±標準差表示；採用t檢驗進行樣本均數比較，用方差分析法進行組內比較，當P＜0。05時，差異顯著，具有統計學意義［1］。

結論

透過對實驗設定的5種纖維蛋白原的提取方法的比較研究，以及對結果的綜合分析得出：反覆冷沉澱法提取的纖維蛋白原純度較高，血液處理量較大，提取效率較高，是5種方法中最佳的纖維蛋白原提取方法。反覆冷沉澱法在純度和提取率方面，均比李凍融法即經典冷沉澱法和冷沉澱法高，但提取週期比徐利強的略長；與冷乙醇法相比，得到的纖維蛋白原的純度略低，但單次處理血量遠大於冷乙醇法，這更適合於工業化生產。本實驗在纖維蛋白原純度和生產週期等後續實驗方面有待進一步改進，將在今後的實驗中對提取得到的纖維蛋白原進行純化，如選用離子交換層析法等分離和純化。此外為了提高提取效率，縮短提取週期，將在提取過程中採取一些改進方法，如在解凍抗凝血漿的過程中採用恆溫迴圈水浴、振盪等方法，最終達到最佳化反覆冷沉澱法提取纖維蛋白原的目的，為提取豬血纖維蛋白原的工業化生產提供依據。

參考文獻

［1］徐利強，李建華，周忠英。冷沉澱凝血因子製備工藝的改良［J］。中國生化藥物雜誌，2011，32（2）：145-146。