乾貨丨雙抗體夾心法

ELISA是Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay的簡稱，即酶聯免疫吸附測定，是研究蛋白抗體的重要方法。它採用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶進行直接或間接結合，然後透過酶與底物產生顏色反應，進行定性和定量分析。1971年Engvall和Perlmann發表了該方法用於IgG定量測定的文章，使得1966年開始用於抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。我們一起聊聊常見的商業化ELISA試劑盒的方法種類以及它們各自的優勢和用途：

ELISA大致分為五種型別：直接法、間接法、競爭法、夾心法、捕獲包被法。在商品化試劑盒中用得比較多的是雙抗體夾心法、競爭法和間接法。

雙抗體夾心法是夾心法中的一種主要形式，我們先談談夾心法吧：

夾心法（Sandwich ELISA）分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法：

雙抗體夾心法中抗原的2個不同的抗原表位被兩個抗體-捕捉抗體和檢測抗體，分別結合。捕捉抗體固定於載體即酶標板上，檢測抗體透過結合抗原進行顯色分析。應用於雙抗體夾心法檢測的捕捉抗體通常是單抗，偶爾有用多抗做為捕捉抗體的情況，但很少見，因為以多抗作為捕捉抗體容易出現交叉反應而降低特異性。檢測抗體通常為多抗，在商業化的科研試劑盒中經常用到生物素標記的山羊多抗，再讓生物素標記的多抗與HRP標記的親和素或者鏈黴親和素結合，然後再加HRP也就是辣根過氧化物酶的底物，通常是TMB反應顯色，這種方法是在傳統的HRP酶標記抗體的雙抗體夾心法ELISA中引入了生物素-親和素放大系統。

不過也有用單抗做檢測抗體的情況，尤其是在科研中。雙抗體夾心法具有高靈敏度、高專一性的優勢，但該法只適用於有多個結合位點的抗原檢測，主要用於檢測各種大分子抗原——例如在醫學檢測中測定HBsAg、HBeAg、AFP等疾病相關的，以及在科研中檢測細胞因子等。由於雙抗體夾心法特異性高，在檢測過程中有時會將樣本和酶標抗體同時加入進行反應，稱為雙抗體夾心一步法，因為操作時間短，在商業化生產中有很大優勢。但雙抗體夾心一步法要特別注意ELISA中的鉤狀效應（hook ffect），因為此時如果樣本中抗原含量過高會導致其與固相抗體和酶標抗體均有結合而無法形成“夾心複合物”，此時測出的結果將低於實際含量甚至是陰性結果。因此，如果使用雙抗體夾心一步法測定樣本中抗原含量時要注意測量的線性範圍，另外使用高親和力的單抗也可削弱鉤狀效應。

雙抗體夾心示意圖

雙抗原夾心法中抗原被包被於固相，檢測樣本中的抗體結合於抗原後，使用酶標的抗原進行結合及後續反應，可以用來測定樣本中的抗體。雙抗原夾心法的關鍵在於酶標抗原的製備，需要根據抗原結構進行設計，在醫學檢驗上測定抗HBsAg抗體採用的就是此法，檢測時被測樣本不需要稀釋即可直接進行測定，故此靈敏度相對而言高於我們隨後要說的間接法。

雙抗原夾心示意圖

競爭法也是一種很常用的方法，一起看看：

競爭法（Competitive ELISA）是用樣本中的遊離抗體/抗原與固相的酶標抗體/抗原競爭性結合的分析方法。當遊離抗體（或抗原）濃度越高，則能與固定抗原（或抗體）結合的酶標抗體（或抗原）就越少，後續顯色就越淺，即與對照相比，顯色越淺，表示檢測樣本中抗體（或抗原）含量越高。該法特別適合小分子物質的檢測也可用於檢測比較不純的樣本，且重複性好，但是檢測的靈敏度和專一性較差。競爭法測抗原常用於檢測小分子抗原及半抗原，這類抗原通常缺乏兩個以上的識別位點，不適用於雙抗夾心法進行測定。該方法在商業化ELISA試劑盒中被廣泛運用。

最後再說說間接法，間接法（Indirect ELISA）只能用於測定抗體，主要用於疾病的診斷，其優點是隻需要改變包被抗原，酶標抗體是通用的。間接法使用了二抗增加訊號強度，也使抗體的選擇多樣化，然而間接法容易產生交叉反應。

好啦，這就是商業化ELISA試劑盒中常用的方法型別。以後我們再給大家分享一些實用的乾貨，敬請期待！

文章來源：每日生物評論

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