CRISPRCas9與RKO細胞結合的應用案例

RKO細胞是由 Michael Brattain 開發的一個低分化的結腸癌細胞系，它含有野生型P53，但缺乏人甲狀腺受體核受體（h-TR beta 1）。RKO細胞系是RKO-E6和RKO-AS45-1的親本細胞系，它的P53蛋白水平高於RKO-E6細胞。 該細胞系可以在裸鼠中成瘤，也可在軟瓊脂中形成集落。目前RKO細胞不僅被廣泛應用於

分子、細胞生物學和生物醫學基礎研究，如

蛋白質組學

、基因組學、細胞系研究、DNA，RNA和遺傳學研究等，還可應用於當今熱門的生物醫藥產業如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌症藥物的研究等

，具有十分廣闊的市場前景。

源井生物提供、活力強、狀態好的野生型RKO細胞，並能適用於各類基因編輯實驗，便於構建各類RKO細胞模型，如基因敲除、敲入、點突變或穩轉細胞株的構建。

具體應用

1。 用於癌症研究，可以驗證由細胞株研究獲得的結果；

2。 預測個體樣本的反應和排斥性，從而選擇最有效的抗癌藥物；

3。 篩選最具選擇性或毒性的新藥化合物；

4。 作為識別靶標進行抗腫瘤藥物篩選與模型建立等。

CRISPR/Cas9技術在RKO細胞中的應用

CRISPR/Cas9系統正在改變許多生物醫學研究前景，包括癌症研究。透過靈活的可程式設計性和誘導DNA雙鏈斷裂，實現了在體外或體內將癌症突變引入細胞。然而，並非所有突變對腫瘤的發生都有同樣的作用，區分腫瘤生長和存活的基本突變和生物惰性突變是很麻煩的。Sayed等人提出了一種在RKO細胞中篩選高通量突變的功能相關性的方法。他們利用CRISPR/Cas9系統探測結直腸癌細胞系中的癌症脆弱性， 使用正篩或負篩從整個集合群體中分離具有特定表型變化的細胞，來嘗試識別新的癌症驅動突變

。他們設計了

100個高質量的sgRNAs，這些sgRNAs能夠特異性切割RKO細胞中存在的突變。然後生成一個包含這些sgRNAs的多功能慢病毒文庫，並用於聯合篩選，以探測這些突變可能的生長條件。收集不同時間點的基因組DNA，PCR擴增、純化sgRNA，並透過深度測序定量sgRNA計數。分析結果顯示，在RKO細胞中，兩個靶向相同突變的sgRNAs（UTP14A：S99delS）將隨著時間的推移而耗盡（圖1A）。實驗結果證實，該突變的失活損害了細胞生長，因此Sayed等人認為UTP14A：S99delS是RKO細胞中的驅動突變（圖1B）。上述的研究結果表明利用CRISPR/Cas9系統能實現在功能上大規模分離癌症突變，這顯然對未來癌症的研究和治療提供了有效的幫助

［2］

。

源井生物已以CRISPR/Cas9技術為基礎研發了獨家CRISPR-U技術專利，CRISPR-U技術具有更高效的基因切割效率，能提高至少10倍的基因編輯效率。目前源井生物向全球提供CRISPR-U技術服務，包括基因敲除/點突變/敲入細胞株、基因編輯載體構建、穩轉細胞株等等。

圖1

RKO細胞中基因編輯的具體案例

RKO 細胞中DIP2C 的缺失在研究人類癌症中的作用

Disco-Interacting Protein 2 Homolog C （DIP2C），是

一種在人體組織和成人腫瘤中高水平表達的非特徵基因，在外顯子組範圍內的激素突變分析中被確定為推定的癌症基因。為了研究

DIP2C失活在人類癌症中的作用並確定受該基因活性影響的過程，Larsson

等人利用

CRISPR/Cas9技術構建了

人類

DIP2C

敲除RKO細胞系

。結果顯示，RKO 細胞中DIP2C 的敲除會導致細胞增大和生長遲緩。並且Larsson等人揭示了表達水平會

受到

DIP2C缺失影響的780 個基因，包括編碼CDKN2A基因的腫瘤抑制基因、編碼上皮間充質轉化（EMT）調節因子的ZEB

1

以及編碼乳腺癌幹細胞的

CD

44

和

CD

24

等等

。

DNA 甲基化分析顯示超過30，000個基因

位點受差異甲基化影響，其中大部分在

DIP2C缺失後發生低甲基化。，而

啟動子區域

DNA 甲基化的變化與基因表達的變化密切相關。DIP2C敲除

後的

RKO

細胞具有更高的創傷閉合容量

，所以

DIP2C的缺失將會觸發癌細胞中大量的DNA甲基化和基因表達變化、細胞衰老和上皮-間質轉化

［1］

。

圖 2 DIP2C的缺失導致基因表達的改變

篩選最具耐藥性的因子，推進抑制劑的研發程序

壞死的細胞死亡途徑是人類病原體防禦的一個關鍵組成部分，在組織穩態過程中可以被異常抑制，從而導致多種型別的組織損傷和疾病。雖然含有

RIPK1、RIPK3和MLKL的壞死體激酶訊號複合物的形成機制已被熟知，但其調控和效應功能的其他機制仍然有待發現。Callow等人透過CRISPR/Cas9進行了全基因敲除篩選了19，883個小鼠蛋白編碼基因，並且透過大規模轉導 RKO 細胞獲得的 sgRNA 參考文庫，篩選出對細胞壞死具有耐藥性的因子，然後鑑定了112個壞死調控因子和介質，包括59個新的候選通路成分，發現在沒有壞死誘導的情況下細胞生長基本不會受到任何影響。他們還進一步表明了一些組織特異性或應激反應途徑可能會透過調節RIPK1來防止受調控的細胞死亡。上述研究結果表明，對RIPK1功能的進一步探索對於推進了新的治療干預策略或臨床抑制劑的開發

［3］

具有重要作用。

圖3 耐藥性因子篩選

全基因組敲除後的RKO 細胞對於放療CRC提供了至關重要的幫助

結直腸癌

（CRC） 在最常診斷的癌症中排名前三，並且是全球癌症相關死亡的主要原因之一。除了手術切除和化療，放療的佐劑也起著關鍵作用，可以延長患者的生存率。然而在放療過程中約有50%的患者會對放療佐劑產生耐藥性，從而導致療效不理想、復發和轉移。因此，確定放射抗性的潛在機制，可以改善結直腸癌患者的治療結果。Yu

等人透過在

RKO

結直腸癌細胞系進行

基因組規模的

CRISPR 敲除篩選，並

結合

NGS 測序，以探索涉及結直腸癌放射抗性的調節因素，最終得到

了

3個候選基因。

他們發現

microRNA-5197-5p（miR-5197）可以顯著增強IR對RKO的細胞毒性。

Yu等人透過進一步的機制研究，證明了miR-5197 直接靶向 CDK6 並抑制其在 RKO 細胞中的表達，可以

誘導細胞週期停滯在

G1/S 期並抑制細胞分裂，因此，miR-5197 增強了放射敏感性。研究結果表明，miR-5197 可能是調節 CRC 細胞放射敏感性的關鍵因素，併為開發對 IR 具有抗性的 CRC 患者的治療策略提供了幫助

［4］

。

圖

4

透過全基因組

CRISPR 敲除篩選鑑定與 CRC 放射抗性相關的候選基因

源井生物目前已憑藉CRISPR-U技術專利自身更高效的切割效率成功在包括RKO細胞的超200多種細胞中成功建立了各類細胞模型，併成功敲除了超5000種基因，為全球不同地區的科研人員提供了一定的幫助。現在源井生物的細胞基因編輯服務正在進行活動大促，價格優惠，歡迎線上諮詢！

參考文獻

［1］ Larsson， Chatarina， et al。 “Loss of DIP2C in RKO cells stimulates changes in DNA methylation and epithelial-mesenchymal transition。” BMC cancer 17。1 （2017）： 1-12。

［2］ Sayed， Shady， et al。 “CRISPR/Cas9 as a tool to dissect cancer mutations。” Methods 164 （2019）： 36-48。

［3］ Callow， Marinella G。， et al。 “CRISPR whole-genome screening identifies new necroptosis regulators and RIPK1 alternative splicing。” Cell death & disease 9。3 （2018）： 1-13。

［4］ Yu， Shijun， et al。 “A Genome-Scale CRISPR Knock-Out Screen Identifies MicroRNA-5197-5p as a Promising Radiosensitive Biomarker in Colorectal Cancer。” Frontiers in Oncology （2021）： 3050。