華中農大李林課題組開發廉價高效的tsCUT&Tag用於體內植物轉錄因子結合位點的快速鑑定

轉錄因子在調節基因表達中起關鍵作用，全面繪製轉錄因子結合位點圖譜將有助於闡明重要作物性狀的基因調控網路，但是目前仍缺乏一種低成本和高通量的植物體內轉錄因子結合位點鑑定方法。雖然染色質免疫沉澱測序（ChIP-seq）和DNA親和純化技術（DAP-seq）應廣泛用於轉錄因子結合位點的研究，但是ChIP-seq受到穩定轉基因材料需求的限制，耗時、成本高且通量低，DAP-seq也侷限在無法真實反映體內轉錄因子與 DNA 的互作。近些年，靶向剪下及轉座酶技術（CUT&Tag）已經成功用於動物和植物組蛋白修飾方面的研究，但是應用於植物轉錄因子方面的研究還較少。

JIPB

近日線上發表了

華中農大李林

課題組題為“

A cost-effective tsCUT&Tag method for profiling transcription factor binding landscape

”

（

https://doi.org/10.1111/jipb.13354

）

的研究論文。

該研究開發了一種瞬時轉化和簡化流程的

CUT&Tag

方法

(tsCUT&Tag)

，即將轉錄因子在植物原生質體中瞬時表達和不依賴於細胞核提取的

CUT&Tag

方法相結合。此方法大大節約樣品準備週期和建庫成本，且與傳統的

ChIP-seq

資料相比具有更高的資料質量和訊號解析度以及更低的測序深度。

此外，該研究提出將

tsCUT&Tag

和

ATAC-seq

資料與機器學習相結合，可以輔助預測植物不同組織轉錄因子結合位點，對於解析植物全生育期的轉錄因子結合圖譜上具有巨大的應用潛力。

tsCUT&Tag技術流程概要如下（圖1A）：先從特定組織中分離植物原生質體，例如玉米黃化苗和水稻綠葉鞘等。將轉錄因子克隆到pM999-GFP載體中，在分離的原生質體中瞬時表達。收集大約10

5

個成功轉染的活細胞，立即固定在ConA Beads上，並用5% Digitonin預處理細胞以結合一抗和二抗以及pG-Tn5轉座酶。最後，基於Tn5轉座酶酶切和PCR擴增構建轉錄因子結合DNA文庫。tsCUT&Tag流程因其省略了交聯、核提取和 DNA 打斷等步驟，使得操作更加簡潔。

為了評價tsCUT&Tag資料的有效性，該研究利用兩個具有代表性的轉錄因子，即玉米中的

TB1

和水稻中的

IPA1

，將tsCUT&Tag與傳統的ChIP-seq資料進行比較。首先，

TB1

和

IPA1

的ChIP-seq和tsCUT&Tag資料表現出高度相關性。在ChIP-seq中鑑定了超過50%的

TB1

和

IPA1

的tsCUT&Tag靶向基因（圖1E）。從tsCUT&Tag鑑定到的

TB1

和

IPA1

基序與ChIP-seq相似（圖1F）。與ChIP-seq峰值訊號相比，

TB1

和

IPA1

的tsCUT&Tag在轉錄起始位點 （TSS） 附近具有顯著更高的訊號（圖1G）。tsCUT&Tag的FRiP 在

TB1

和

IPA1

中都遠高於ChIP-seq，表明tsCUT&Tag的信噪比高（圖1I）。這些結果表明tsCUT&Tag在鑑定轉錄因子結合位點上優於ChIP-seq，具有較低的測序深度和較高的訊號解析度。

由於很難從植物不同組織中獲得高質量的原生質體並實現高效率轉化，為了推斷不同組織和發育階段轉錄因子的動態調節網路，該研究利用tsCUT&Tag和ATAC-seq資料結合機器學習的方法來預測不同組織中的TFBS。以

ZmKNOX6

為例，三種機器學習模型（LTSM、TCN 和 SVM）的AUC值在0。91到0。94之間。預測靶基因在兩兩機器學習模型之間的重疊率高達 73%。與tChIP-seq檢測到的綠葉

ZmKNOX6

靶基因相比，三種機器學習模型預測的靶基因重疊率（68%~69%）顯著高於陰性對照和隨機開放染色質。結果表明，tsCUT&Tag方法可以與機器學習相結合，可輔助跨不同植物組織間TFBS的鑑定。

本文開發了一種廉價高效鑑定植物轉錄因子結合位點方法tsCUT&Tag，為體內研究轉錄因子與DNA的互作提供了一條新的可行性途徑。