技術：含酚廢水處理研究

技術 | 含酚廢水處理研究

1、引言

苯酚（phenol）作為一種原生質毒物，對環境造成嚴重汙染，長期飲用被苯酚汙染的飲用水或食物，對人類的健康將造成極大的危害，苯酚對人體面板、粘膜有強烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經或損害肝、腎功能，吸入高濃度蒸氣可致頭痛、頭暈、乏力、視物模糊、肺水腫等。因此，美國環保署把苯酚列入129種優先汙染物和65種有毒汙染物之列，中國也將苯酚列入環境優先處理的汙染物“黑名單”之中（Bashaetal，2010）。

國內外苯酚主要的生產方式為氯苯水解法、苯磺酸鈉鹼熔法、異丙苯氧化法等，為了提高苯酚產量，常在生產過程中加入無機鹽催化劑，並進行pH調節，此過程會使得體系中鹽度增大，後期廢水中不僅含有苯酚等有機汙染物，也含有大量的鹽分（Ca2+、Mg2+、Cl-、Na+）使廢水難以處理。目前含酚廢水處理手段主要有兩大類，即生物處理法和物理處理法。由於生物處理法具有操作較簡單、成本低廉、處理效果好、所需要的環境條件比較溫和、對環境造成的二次汙染很小等優點，已被廣泛用於苯酚廢水的處理之中。目前國內外學者在苯酚廢水處理方面做了大量的研究，並篩選出多種具有良好苯酚降解效果的苯酚降解菌，但是這些菌耐鹽能力弱，當酚類廢水中鹽度超過一定濃度，其生長以及降解苯酚的效果會受到嚴重影響。利用耐鹽高效苯酚降解菌株對苯酚進行降解，不僅可以有效的降解廢水中的苯酚，也解決了一般菌株在高鹽條件下難以降解苯酚的難點。另外，對微生物苯酚降解效果產生影響的因素較多，傳統的單因素實驗難以區分各個因素之間的主次，所以尋求耐鹽高效苯酚降解菌及其最佳降解條件具有重要意義。

本實驗透過篩選、分離、馴化得到在高鹽條件下以苯酚為唯一碳源能源的苯酚降解菌，經耐鹽和苯酚降解能力測定，得到耐鹽高效苯酚降解菌zhtI。對耐鹽高效苯酚降解菌zhtI菌落形態、菌體特徵、生理生化反應、16SrRNA序列分析確定菌株的種屬，利用響應面法（RSM）進行最佳化處理從而提高苯酚降解菌zhtI的降解效率，並對耐鹽高效苯酚降解菌zhtI進行降酚動力學研究，研究結果將為生物法處理苯酚廢水提供新的技術思路。

2、材料與方法

2.1樣品來源及耐鹽高效苯酚降解菌的分離與純化

透過逐漸提高苯酚濃度的馴化方法，將水樣樣品按2%的接種量接種於以100mg·L-1苯酚為唯一碳源，鹽度2%的無機鹽培養基中；溫度30℃、搖床轉速200r·min-1，好氧培養2d後，以2%接種量轉接至苯酚濃度為200mg·L-1，鹽度2%的無機鹽培養基中，繼續培養，直到苯酚濃度達到1000mg·L-1；然後進行平板塗布，將培養皿放於30℃恆溫培養箱中培養72h，挑取單菌落，轉接至苯酚濃度1000mg·L-1，鹽度2%的無機鹽培養基中；經反覆平板塗布，最後篩選出具有耐鹽高效苯酚降解能力的菌株，儲存在鹽度2%，苯酚濃度為100mg·L-1的LB固體培養基上。

2.2培養基

富集培養基（LB培養基）：蛋白腖10g·L-1，酵母膏5g·L-1，鹽度2%，pH值7。0，121℃下滅菌20min，備用（LB固體培養基需加入18%瓊脂粉）。

無機鹽培養基（MS培養基）：KH2PO41g·L-1，NaCl0。1g·L-1，（NH4）2SO40。04g·L-1，MnSO4。H2O0。01g·L-1，NaH2PO40。4g·L-1，MgSO4。7H2O0。1g·L-1，Fe2（SO4）3。H2O0。01g·L-1，NaMo4。2H2O0。01g·L-1，加水定容至1000mL，121℃下滅菌20min，備用。

2.3實驗方法

2.3.1菌體細胞濃度測定

用分光光度計，測定光密度（OD值）設定為600nm，進行菌體濃度測定。

2.3.2苯酚濃度的測定

運用4-氨基安替比林法測定苯酚的含量（潘傑等，2015）。

2.3.3形態特徵鑑定

用肉眼觀察菌落的形狀、大小、顏色、邊緣特點、透明度、粘稠度、溼潤度以及是否隆起。透過染色劑對降解菌進行染色（革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色、莢膜染色等），在高倍顯微鏡下觀察染色結果，並用掃描電鏡觀察菌體表面形態。

2.3.4生理生化特性的測定

按照《伯傑氏細菌鑑定手冊》（Garrity，1974）進行甲基紅實驗、過氧化氫酶實驗、吲哚實驗、澱粉水解實驗、硝酸鹽還原實驗、乳糖氧化發酵、明膠液化實驗、VP實驗、精氨酸雙水解途徑檢測。

2.3.5 16SrDNA序列分析

擴增通用引物：27F5′-AGACTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R5′-ACGGTTACCTGTTACGACTT-3′

擴增體系設計：模板DNA液10μL、10×PCRBuffer5μL、dNTP1μL、Taq酶2μL、兩種引物各1μL、ddH2O31μL。

PCR擴增反應條件：95℃（5min）預變性→［95℃（30s）→55℃（30s）→72℃（90s）］（35cycles）→72℃（10min）→4℃（holding）

PCR擴增產物電泳實驗，獲得目的條帶，將PCR擴增產物交上海生工生物工程有限公司進行測序，將測序結果進行16SrRNA序列分析確定菌株的種屬。

2.4降解條件最佳化

實驗選取苯酚濃度、葡萄糖濃度、接種量、溫度、pH值、鹽度等6個對菌株zhtI降解苯酚影響最明顯的因素，根據Placket-Burman實驗設計原理，對11個考察因素進行N=12的組合實驗，以苯酚降解率為響應值，從中篩選出對菌株降解苯酚影響最顯著的3個因素；再透過中心組合實驗設計原理，以Box-Benhnken設計進行實驗，最後用DesignExpert軟體對實驗資料進行處理，得到最佳降解條件組合

2.5耐鹽苯酚降解菌的降酚動力學研究

本文在降解菌的最佳培養條件下，以苯酚作為唯一碳源和能源，測定菌株對NaCl的最大耐受能力，根據每次實驗測得的苯酚濃度和菌體生長量，求出不同苯酚濃度所對應降解速率，然後求出比降解速率值，最後運用origin7。5軟體對實驗資料進行非線性擬合，得出相應的動力學引數，鑑定菌株是否符合底物抑制模型。

3、結果與討論

3.1菌株的分離及鑑定

3.1.1菌株的分離

透過逐步提高苯酚濃度，從挑取的97個單菌落中分離純化得到12株具有耐鹽高效苯酚降解能力的菌株，分別命名為zhtA、zhtB、zhtC、zhtD、zhtE、zhtF、zhtG、zhtH、zhtI、zhtJ、zhtK、zhtL。對分離純化得到的12株耐鹽高效苯酚降解株進行降酚能力的測定，其中菌株zhtI的降解效果最佳，苯酚的降解率達到了80%以上。由此可知，在高鹽條件下菌株zhtI對苯酚的降解能力最強。

3.1.2菌株的鑑定

對菌株進行形態特徵鑑定，結果顯示，菌株zhtI菌落呈圓形、白色、邊緣整齊、中間隆起、溼潤有光澤、較粘稠、不產色素，呈桿狀，無端生鞭毛，無莢膜結構，無芽孢結構。菌株zhtI的革蘭氏染色陽性、甲基紅實驗陰性、過氧化氫酶陽性、吲哚實驗陰性、精氨酸雙水解酶實驗陽性、VP實驗陰性、澱粉水解實驗陰性、硝酸鹽還原實驗陽性、乳糖氧化發酵陰性、明膠液化實驗陽性。根據《伯傑氏細菌鑑定手冊》初步確定菌株zhtI為不動桿菌屬（Acinetobactersp。）。

圖1菌株zhtI的菌落形態及掃描電鏡

菌株zhtI的16SrDNA經過PCR擴增得到一條大小在1400bp左右的片段。測序得到菌株zhtI的16SrDNA核苷酸序列全長為1339bp。經過BLAST同源性比對，菌株zhtI與Acinetobacterguillouiae（Genbank登入號為：KC904085）的同源性達到100%，按照16SrDNA序列的同源性在97%即為同一個種的標準，初步鑑定菌株zhtI為一株Acinetobacterguillouiae。菌株zhtI的系統發育樹如圖2所示。

圖2菌株zhtI的系統發育樹

3.4菌株降酚效率的影響因素及降酚條件最佳化

3.4.1培養條件對降酚效率的影響及分析

透過單因素實驗得出，NaCl濃度為3%時，菌株zhtI對苯酚的降解率達到最大值85。4%。在苯酚濃度為800mg·L-1時，降解率達到最大值87。1%；當苯酚濃度高於800mg·L-1時，菌株zhtI的生長量及其對苯酚的降解率均逐步下降；當pH值為7。5時，菌株zhtI對苯酚的降解率達到最大值；當接種量為6%時，菌株的生長量和苯酚降解率最高，而當接種量超過6%時，菌株的生長量和苯酚降解率變化均不明顯；當溫度為30℃時，菌株zhtI對苯酚的降解率達到最大值，當溫度高於30℃時，菌株zhtI對苯酚的降解率和生長量均下降；外加碳源對菌株zhtI降解苯酚的效率影響較大，初始過程中菌株降解苯酚受到一定抑制，這是由於外加碳源被優先利用，但在後期苯酚的降解率上升明顯，其中新增葡萄糖對菌株zhtI降解苯酚的促進作用最佳，能使苯酚的降解率達到91。6%；外加硝酸類氮源會使菌株zhtI降解苯酚的效率受到抑制，培養基中存在的NO-3是苯酚降解酶系的非競爭性抑制劑，使酶的活性降低，這與以硝酸鹽作為外加氮源會影響或抑制菌株對苯酚的降解研究結果一致。

3.4.2菌株zhtI降酚條件的最佳化

(1)Placket-Burman實驗結果

根據Placket-Burman設計原理得出實驗結果如表1所示。

表1Placket-Burman實驗設計結果

從表1可知，實驗組5的苯酚降解率最高，達到93。79%；實驗組12的苯酚降解率最低為40。37%。運用SPPS19。0軟體進行擬合，得到方程：Y=69。93-8。71X1+43X2+9。85X3-0。62X4+4。71X5-1。14X6

X1表示苯酚濃度（mg·L-1）；X2表示葡萄糖濃度（%）；X3表示pH值；X4表示接種量（%）；X5表示溫度（℃）；X6表示鹽度（%）。

透過DesignExpert軟體分析得到模型P=0。0355，說明該模型在研究區域擬合性良好；一般情況下變化係數越低說明實驗的可信度和精確度越高，本實驗變化係數為11。78%，表示Placket-Burman實驗可信度和精確度比較高。線性迴歸分析結果如表2所示。

表2 Placket-Burman實驗分析結果

從表2可知苯酚濃度、葡萄糖濃度及pH值對菌株zhtI降解苯酚的影響比較顯著，其影響大小順序為苯酚濃度（P=0。0134）>pH值（P=0。0193）>葡萄糖濃度（P=0。0211），其它因素對菌株zhtI降解苯酚的影響P值均大於0。05，所以影響效果不顯著。由此可推斷，酚濃度、葡萄糖濃度及pH為影響菌株zhtI降解苯酚的關鍵因素。

(2)響應面法對菌株zhtI降酚條件的最佳化

由2。5。1節篩選出3個對菌株zhtI苯酚降解效率產生影響的主要因素，即苯酚濃度、葡萄糖濃度、pH值，根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，以苯酚降解率作為響應值，設計3因素3水平的響應面分析實驗，組合方案見表3。

表3中心組合實驗方案

苯酚濃度A、葡萄糖濃度B、pH值C作如下變換Z1=（A-800）/10、Z2=（B-6）/1、Z3=（C-7。5）/10，以A、B和C為自變數，以苯酚降解率（Y）為響應值進行實驗設計。結合響應面分析三維圖（圖3），可更加直觀地看出各個因素之間的相互作用，以及各個因素對苯酚的降解不是簡單的線性關係，對響應值大小的影響存在一極值點。

圖3影響菌株zhtI降解苯酚的各因素互動作用響應曲面採用SASRSREG程式對響應值與各因素進行處理，進行迴歸擬合後，得到迴歸方程：

採用SASRSREG程式對響應值與各因素進行處理，進行迴歸擬合後，得到迴歸方程：

Y=93。08+0。91Z1-2。66Z2-0。33Z3-2。72Z1Z2-0。40Z1Z3+1。00Z2Z3-2。90Z21-3。10Z22-10。582Z3，以及迴歸模型係數的顯著性檢驗結果見表5。

從表4方差分析結果（F值）可得，對苯酚降解效率產生影響的3個因數大小依次為：葡萄糖濃度（Z2）>苯酚濃度（Z1）>pH值（Z3），其中失擬項數值大小為0。3317，大於0。05，表示失擬不顯著，因此該模型穩定，可作為各個因素水平對苯酚降解率影響的預測。根據迴歸方程，得到A=801。6，B=5。56，C=7。3，即苯酚濃度為801。6mg·L-1，葡萄糖濃度為5。56%，pH值為7。3。將Z1、Z2、Z3代入迴歸方程可得Y=93。23，即菌株zhtI能使苯酚的降解率達到93。23%。

表4 Box-Behnken實驗迴歸分析結果

(3)驗證實驗

為了檢驗響應面分析方法的可靠性，按照最佳化後的條件（苯酚濃度801。6mg·L-1、葡萄糖濃度5。56%、pH值7。3、接種量6%、溫度30℃、鹽度3%）進行苯酚降解實驗（3次平行實驗），培養72h，結果檢測到苯酚降解率分別為93。68%、92。47%、93。02%，取平均值為93。06%，預測值與實驗結果之間偏差非常小，具有良好的擬合性，最佳化後菌株zhtI對苯酚的降解能力得到提升。說明響應面法能有效的對實驗條件進行最佳化和預測，節約成本。

3.5菌株zhtI的降酚動力學研究

3.5.1菌株zhtI對苯酚耐受性檢測結果

菌株zhtI在pH值7。3、接種量6%、溫度30℃、鹽度3%、搖床轉速200r·min-1的不同苯酚濃度MS培養基中培養72h。菌株zhtI的最高耐受苯酚濃度為1750mg·L-1，當苯酚濃度過高時，菌株zhtI的生長會受到抑制甚至失活。對菌株zhtI進行降酚的動力學研究，降酚解動力學的相關資料如表5所示。

表5菌株zhtI苯酚降解動力學實驗資料

將表5中的資料與Andrews抑制方程模型進行多元線性迴歸，如圖4所示，得到公式中的模型引數為：μmax=2。142h-1，KS=126。952mg·L-1，Ki=476。191mg·L-1。模型方差為R2=0。9979。可知苯酚降解模型動力學方程曲線與實驗值的擬合良好。對Andrews抑制方程求導可得

mg·L-1，此時μ取最大值為1。054h-1。

圖4苯酚降解模型動力學方程擬合曲線與實驗值

4、結論

1）將篩選出的耐鹽高效苯酚降解菌zhtI進行菌落形態、個體特徵、生理生化鑑定，初步確定菌株zhtI為不動桿菌屬（Acinetobactersp。）。對菌株菌株zhtI進行16SrDNA基因測序分析，透過BLAST與Genbank中相關序列比對以及MEGA4。1構建系統發育樹，確定菌株zhtI為Acinetobacterguillouiae。

2）透過單因素實驗確定菌株最適鹽度為3%，最適苯酚濃度為800mg·L-1，最適pH值為7。5，最適接種量為6%，最適生長溫度為30℃，最適外加碳源為葡萄糖，外加NO-3類氮源對菌株降解苯酚有抑制作用；利用Plackett-Burman實驗確定葡萄糖濃度、苯酚濃度、pH值為菌株降解苯酚的3個主要因素，採用中心組合實驗設計，結合Box-Behnken實驗設計及響應面分析，確定最優降解條件為：苯酚濃度801。6mg·L-1、葡萄糖濃度5。56%、pH值7。3、接種量6%、溫度30℃、鹽度3%，該條件下培養72h，菌株zhtI對苯酚的降解率可達到93。23%。

3）菌株zhtI以苯酚為唯一碳源，接種於pH值7。3、接種量6%、鹽度3%、溫度30℃的液體MS培養基中，搖床轉速200r·min-1培養72h，菌株zhtI對苯酚的最大耐受濃度為1750mg·L-1。菌株zhtI降解苯酚的動力學模型符合典型的底物抑制模型，動力學引數為：μmax=2。142h-1，KS=126。952mg·L-1，Ki=476。191mg·L-1。