腫瘤大作戰之多組學手段深度解析三陰乳腺癌耐藥機制

乳腺腫瘤4a是什麼意思

研究簡介

4月中旬發表在《Cell》雜誌上的一項由美國MD安德森癌症中心聯合瑞典卡羅林斯卡學院研究人員進行的研究中［1］，利用單細胞DNA、RNA測序技術以及基於大量細胞的外顯子測序技術對三陰乳腺癌展開分析，主要解決兩個問題：1。探索為什麼同樣的TNBC病人會對新輔助化療產生不同的反應呢？2。化療耐受後的腫瘤裡面的突變之前就存在，還是治療途中新產生的呢？

原文檢索

Chemoresistance Evolution in Triple-Negative Breast Cancer Delineated by Single-Cell Sequencing

DOI： https：//doi。org/10。1016/j。cell。2018。03。041

背景

三陰乳腺癌（Triple-negative breast cancer， TNBC）是乳腺癌中一種極具侵略性的亞型，約佔乳腺癌患者群體的12%-18%。TNBC患者因缺乏雌激素受體（ER）、孕酮受體（PR）以及HER2受體無法接受激素或抗Her2療法，標準治療方法是接受新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy， NAC）。30-50%的患者群體出現NAC抗藥性，導致較低的生存率。對於化療抗性是來自於選擇和擴大化療前就存在的罕見亞克隆還是在化療過程中選擇性的引入新的突變，還是個知識空缺。

研究手段

患者:

20人，均接受NAC，10人NAC治療受益，10人NAC治療出現抗性

Bulk

外顯子測序:

20人，來源於治療不同時期配對樣本

Roche SeqCap EZ v2 kit

HiSeq2000 / HiSeq4000

Tumor 180×； Normal 125×

Bulk

擴增子測序:

治療前的腫瘤樣本

擴增產物150 bp

MiSeq SE150， 1，671，000×

單細胞

RNA

測序:

8人，共計6，862個細胞，來源於治療不同時期樣本

單細胞捕獲分選平臺［2］：WaferGen ICELL8 v2

HiSeq4000， 1。2 M reads/Sample

單細胞

DNA

測序

(DOP-PCR)

:

8人，共計900個細胞，來源於治療不同時期樣本

單細胞分選平臺：FACSAria II flow cytometer

HiSeq2000 / HiSeq4000

0。1×，分析複製數變化

圖1 NAC治療時間軸與實驗設計總覽

結果

1-

使用腫瘤組織進行外顯子測序，分析

響應

NAC

後克隆中的持久與消退突變

患者P1-P10為從NAC治療中受益的患者，透過對治療前、中、後的腫瘤樣本體細胞突變進行分析（Bulk WES），發現在治療前腫瘤細胞中存在的突變在治療後都檢測不到了（圖2A、C），說明NAC治療有效消除了含有這些突變的克隆群體。而P11-P20這10位對NAC療法產生抗性的患者，治療後仍然能夠部分檢測到治療前就存在的體細胞突變，甚至還能夠檢測到治療前不存在的體細胞突變（圖2B、D）。

圖2 NAC受益患者與NAC抗性患者治療前後體細胞突變與克隆動態變化

此時，研究者們提問，是否這些NAC治療後新出現的突變，真的在治療前的腫瘤細胞中真的就不存在？還是因為WES的測序深度不夠，導致沒有檢測到？隨後對其中五名NAC抗性患者治療前腫瘤樣本進行高深度的擴增子測序（1，671，000×），發現4/5的患者NAC治療前樣本中能夠檢測到新的突變（圖3），說明含有這些突變的克隆一開始就存在於腫瘤組織中，只是頻率極低。

圖3 化療抗性患者接受NAC治療前的腫瘤樣本深度測序結果

結果

2-

使用單細胞

DNA

測序，分析

響應

NAC

治療前後

CNA

演化過程

NAC

受益患者群體

在僅考慮CNA變化的情況下，透過t-SNE分析發現治療前和治療後的細胞清晰分為兩塊，並且治療前細胞為癌細胞特徵（非整倍體），而治療後細胞為正常細胞特徵（圖4A）。此外，治療前的癌細胞根據CNA差異分為2-3個不同亞克隆群體（A、B、C），透過TimeScape進行克隆動態變化分析發現這些亞克隆會隨治療過程逐漸消失（圖4B-E）。

圖4 NAC受益患者群體的複製數演變過程

NAC

抗性患者群體

在僅考慮CNA變化的情況下，根據t-SNE分析的結果發現治療前、後的細胞混合在一起，並且均表現為腫瘤細胞特徵（非整倍體）。此外，治療前、後的細胞在不同樣本中根據CNA的變化情況可以聚為2-5種不同的亞克隆群體（A、B、C、D、E）。透過TimeScape進行克隆動態變化分析，大多數亞克隆之間存在共有的CNA事件，但部分CNA僅於某些克隆中存在，如P14患者中，抗性關聯克隆A出現了3號染色體上的2個缺失，長5。3 Mb（IL5RA、RARB），含有這兩個突變的克隆佔比從治療前的7。7%增加到了71。8%（圖5B），這說明了NAC抗性患者在治療前腫瘤組織中就存在了變異，但是隨著NAC治療的誘導，部分克隆透過更好的適應性佔比不斷增加，導致腫瘤抗性產生。

圖5 NAC抗性患者群體的適應性複製數演變過程

結果

3-

使用單細胞

RNA

測序，分析

響應

NAC

前後轉錄本變化過程

NAC

受益患者群體

利用已經發表的240個染色體倍性正常乳腺細胞的複製數資料作為normal control［2］，基於單細胞RNA測序得到的每個基因的read counts，分析治療前後細胞的複製數變化情況。根據圖6A結果所示，治療前的細胞聚為一個cluster，且呈現癌細胞的非正常倍性。治療後的細胞與normal樣本聚為一個cluster，表現為正常倍性，說明透過NAC治療癌細胞減少。圖6B中為在僅考慮每個細胞的基因表達譜特徵情況下，根據t-SNE分析發現治療前後的細胞清晰分為兩塊，擁有不同的表達模式。圖6C中展示了12個在4個NAC受益患者中治療前相對於治療後細胞均高表達的基因集。圖6D使用GSVA分析找出了該患者群體的腫瘤細胞中可能對NAC治療敏感的相關通路（在治療前的癌細胞中高度富集，但是透過NAC治療後GSVA score顯著降低）。

圖6 NAC受益患者的治療前後單細胞轉錄圖譜

NA

C

抗性患者群體

對於NAC治療產生抗性的患者群體，先根據單細胞RNA測序資料進行CNA分析（圖7A），不論在治療前還是治療後細胞均呈現出腫瘤細胞非整倍體特性，並且治療前後的細胞呈現出不同的表達譜特徵（圖7B、C）。

圖7 NAC抗性患者化療抗性腫瘤細胞的轉錄重編碼

上述結果說明了：就複製數變化而言，治療前就預先存在含有特定基因型的克隆，並存在選擇適應性。而就細胞的表達譜而言，治療後的細胞可能因響應NAC出現了表達譜的重編碼，向抗性表達譜轉變，使抗性表型得以實現。

雖說研究者沒有在治療前的細胞中找出與治療後細胞完全相同的表達模式，但是研究者在NAC抗性患者中鑑定出治療前表達部分抗性相關基因的“primed cells”（圖8A）。“primed cells”中表達的這部分基因如果在患者接受NAC治療前就能夠檢測到其表達，那可能暗示著該患者接受NAC治療後可能會出現抗性表達譜，呈現抗性表型。

圖8治療前腫瘤細胞中表達部分抗性基因的“primed cells”

結果

4-

化療抗性模型

綜上結果，三陰乳腺癌患者NAC耐藥性相關基因型是先天存在的，並且因新輔助化療的選擇而適者生存，含有此類基因型的克隆在腫瘤細胞中佔比隨響應NAC而增大；與此同時，化療誘導了轉錄譜的重程式設計，從而產生了耐藥表型。

圖9 TNBC患者對NAC治療產生抗藥性的適應性與獲得性模型

最後作者還寫道：“在接受化療之前，檢測三陰乳腺癌患者的耐藥克隆，也許有助於預測哪些患者有望從化療中受益。其次，將患者分化為克隆消退組和克隆持續組，可能對患者的預後或生存有意義。第三，我們關於耐藥表型的資料有望開發出克服耐藥性的治療策略。”

腫瘤的突變、演化、轉移以及耐藥無不與腫瘤的異質性（Heterogeneity）密切相關，它是腫瘤最難以捉摸的一層“面紗”。是否研究物件無法縮小到單細胞水平，就一定研究不了腫瘤的異質性呢？隨著生物資訊學的發展，我們可以基於腫瘤組織樣本中的體細胞突變以及複製數變化、LOH等資訊，透過計算突變的體細胞比例，進行聚類分析，同樣也可以分析得出腫瘤樣本中的克隆結構，並對不同克隆進行單獨分析。

基於上述邏輯，

微分基因也為關注腫瘤異質性、耐藥性的研究者們開發了針對性的腫瘤高階分析產品，透過腫瘤組織中的突變資訊，利用

ABSOLUTE3、Pyclone4

等軟體進行分析，深入瞭解腫瘤的異質性。

具體分析流程如下：

注:

如樣本進行外顯子測序，資料分析結果中不包括SV檢測與註釋、融合基因分析、非編碼區高頻突變分析。

對於研究中進行單細胞分選的WaferGen ICELL8高通量單細胞分選平臺，是基於轉錄水平研究腫瘤異質性的“利器”（尤其是在目前針對乳腺癌腫瘤異質性的研究［2］），具有通量高（up to 1，800 cells），可觀測細胞（保證“活”細胞），週期快，價格低的特點，解決了傳統單細胞擴增中通量低，價格貴的問題。透過ICELL8平臺進行單細胞分選後，經過擴增、表達譜建庫、測序、生物資訊分析，快速得到不同細胞間的差異基因表達譜。

微分基因是美國

WaferGen ICELL8

高通量單細胞分選平臺在中國的唯一代理商，我們也將利用該平臺在單細胞轉錄組水平上的研究優勢，結合腫瘤全基因組、全外顯子組等其他組學的資訊，共同揭開腫瘤“異質”的面紗。

參考文獻:

［1］ Kim C， Gao R， Sei E， et al。 Chemoresistance Evolution in Triple-Negative Breast Cancer Delineated by Single-Cell Sequencing［J］。 2018。

［2］ Gao R， Kim C， Sei E， et al。 Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer［J］。 Nature Communications， 2017， 8（1）：228。

［3］ Carter S L， Cibulskis K， Helman E， et al。 Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer［J］。 Nature Biotechnology， 2012， 30（5）：413-421。

［4］ Roth A， Khattra J， Yap D， et al。 PyClone： statistical inference of clonal population structure in cancer。［J］。 Nature Methods， 2014， 11（4）：396-398。