想要試管嬰兒？瞭解一下都有哪些輔助生殖技術

單位：無憂文秘

自 １９７８ 年世界上第一位試管嬰兒誕生以來，關於輔助生殖技術（ＡＲＴ ）其中一個重要問題是其相對較低的每週期活產率。根據 ２００９ 年在 歐洲人類生殖 與 胚 胎 協 會（ ＥＳＨＲＥ ）登記的５０多萬名試管嬰兒的資訊，透過自身新鮮胚胎移植的女性，包括體外受精（ ＩＶＦ ）和 卵 胞 漿 內 單 精 子 注 射 技 術（ ＩＣＳＩ ），其週期的活產率是 ２２％ ，冷凍週期移植的活產率是 １５％ ，而透過贈卵移植的女性，新鮮週期和冷凍週期移植的活產率達到了 ３０％［ １ ］ 。這些指標明顯低於２００９ 年由美國疾病控制中心（ ＣＤＣ ）公佈的相關資料。美國ＣＤＣ公佈的資料顯示，自身新鮮卵子或胚胎移植的活產率是 ３７％ ，冷凍週期是 ３０％ ，而透過贈卵進行新鮮週期和冷凍週期移植的活產率分別是５５％和３４％ 。

ＥＳＨＲＥ 與美國 ＣＤＣ 兩者公佈資料差異的一部分原因可能是由於美國的 ＡＲＴ 臨床機構公佈ＡＲＴ結局時存在偏差 ［２ ］ 。但需要強調的是，這些資料主要是用作參考和了解大規模經 ＡＲＴ 助孕人群的治療情況，而並非用來進行系統分析和統計。儘管近些年來 ＡＲＴ 週期移植的活產率有小幅度增高，但 ＡＲＴ 的成功率仍沒有達到令人滿意的程度。近十幾年許多研究者和研究機構投入了大量人力、物力、財力用於研究超數排卵藥物治療，配子獲取和成熟技術，助孕技術，配子、胚胎的體外培養和冷凍儲存，胚胎的優選，胚胎移植的質量控制，黃體期支援治療；卵巢過度刺激綜合徵的預防及子宮內膜的移植條件等其他因素 ［３ ］ 。從這些巨大的投入來看， ＡＲＴ 技術本身就可能會影響週期活產率。目前有許多文獻報道了 ＡＲＴ對印記紊亂、印記基因甲基化水平及 ＡＲＴ 子代健康的潛在影響 ［４ － ６ ］ ，但是關於 ＡＲＴ引起的表觀遺傳修飾改變對活產率的影響卻鮮有報道。 ＡＲＴ 治療過程中的各項體外操作和體外培養是在胚胎發生全基因表觀遺傳重程式設計這一特殊發育時期進行的 ［７ ］ 。因此這些人為操作可能會導致胚胎的表觀遺傳修飾紊亂，進而影響移植前胚胎的發育和 ＡＲＴ 週期活產率。現就 ＡＲＴ治療過程中的各項體外操作和體外培養對週期活產率影響的相關研究進展進行綜述。

１ 卵巢刺激

目前認為，卵細胞在生長階段將會進行表觀遺傳標記，這一過程發生在卵細胞減數分裂完成和排卵之前 ［８ ］ ，這提示超數排卵過程可能改變卵細胞的表觀遺傳修飾，進而影響後續的 ＡＲＴ活產率。超數排卵可能使卵細胞發育速度過快，卵細胞不夠成熟或者發生選擇性閉鎖，這種負面效果會影響卵細胞的質量，並且可能會干擾卵細胞在發育過程中的甲基化印記和移植前胚胎甲基化印記的維持。在對小鼠的研究中發現，超數排卵對母源印記表達基因（ Ｈ１９ ）和 父 源 印 記 表 達 基 因 （ Ｓｎｒｐｎ ， Ｐｅｇ３ ，Ｋｃｎｑ１ｏｔ１ ）的甲基化水平的影響存在劑量效 應關係 ［９ ］ 。此外，外源性激素藥物的應用可能改變子宮環境，影響子宮內膜的成熟 ［１０ ］ 和參與正常子宮內膜容受性基因的轉錄活性 ［１１ ］ ，因此會干擾基因印記的維持。

最近一篇文獻綜述認為，與女性卵細胞基因獲取印記相比，卵巢刺激對基因印記維持的不良效應更加顯著 ［１２ ］ 。但是，這項研究存在一定的缺陷，這些卵細胞均來自ＩＶＦ或ＩＣＳＩ週期中質量較差的卵細胞，這些卵細胞對人絨毛膜促性腺激素（ｈＣＧ ）的促進卵子成熟作用反應不佳，因此該文獻的結論可信度不高。

２配子低溫貯存

卵子和精子的低溫貯存均可能會影響受精之前的配子和移植前胚胎的基因印記。上述提到，卵細胞減數分裂完成和排卵之前，卵細胞在生長階段將會發生表觀遺傳標記。同樣地，竇狀小卵泡的全基因組 轉 錄 活 性 沉 默 是 發 生 在 減 數 分 裂 完 成 之前 ［１２ － １３ ］ 。同時，成熟的卵泡儲存了大量的 ｍＲＮＡ ，這些 ｍＲＮＡ 攜帶了許多在減數分裂期、受精時和移植前發育階段所需蛋白的編碼資訊，包括卵細胞特異性 ＤＮＡ 甲基化轉移酶（ ＤＮＭＴ１ｏ ），這種酶在早期發育階段起著維持基因甲基化標記的作用 ［１４ ］ 。因此，卵細胞中儲存的資訊對卵子成熟、受精和移植前胚胎髮育階段，具有表觀調控的作用。

２． １卵子冷凍

與慢速冷凍卵子相比，卵子玻璃化冷凍解凍後更容易存活，具有較高的胚胎髮育潛能。另外，經過玻璃化冷凍的卵子，其受精率、移植率、妊娠率和活產率均接近於新鮮的卵子（針對的主要是年齡不超過３４歲的女性）［ １５ － １６ ］ 。但另有一篇設計良好的配對隨機對照試驗研究認為，玻璃化冷凍卵子行 ＩＣＳＩ 時的受精率較差，並且受精成功的胚胎髮育至囊胚速度較慢，但是關於非整倍性囊胚的發生率和繼續妊娠率，玻璃化冷凍卵子組與非玻璃化對照組之間相近 ［１７ ］ 。

關於玻璃化冷凍尚未成熟的人卵細胞的一些研究表明，與卵子體外成熟相比，玻璃化冷凍並沒有導致印記甲基化紊亂的風險增加 ［１８ ］ 。同時研究發現，可編碼８個與胚胎髮育密切相關的蛋白質轉錄本，它們在玻璃化冷凍後解凍的卵子與在人減數分裂中期（ＭⅡ ）的新鮮卵子中含量相近［ １９ ］ 。但也有研究認為，人 ＭⅡ 期卵子經玻璃化冷凍和慢速冷凍後解凍均減少卵細胞中儲存的轉錄本水平 ［２０ ］ 。

２． ２ 精子冷凍

相反，精子印記標記是一個逐步重建的過程，從胎兒發育時期的原始生殖細胞開始，到出生後精子減數分裂仍繼續進行著 ［２１ ］ 。男性精子的甲基化印記在 Ａ 型精原細胞就已經建立，並透過精子生成過程中 ＤＮＭＴｓ的 ｍＲＮＡ 表達和蛋白合成來維持其甲基化印記。精細胞基因組某些區域由組蛋白而非魚精蛋白包被，使得精子基因組結構不至過於緊密，這有利於受精前基因進行轉錄。另外，精子的核組蛋白成分可以豐富有活性的逆轉座子，這種逆轉座子維持精子基因組某些區域的轉錄活化狀態。精原細胞也具有翻譯活性，可以利用線粒體酶翻譯來自細胞核和線粒體的轉錄本 ［１７ ］ 。

目前尚缺乏比較新鮮精子、慢速冷凍精子及玻璃化冷凍精子之間的 ＡＲＴ 活產率的臨床隨機對照試驗。但是已瞭解到，慢速冷凍人類精子可以造成精子 ＤＮＡ 碎片化，但精子慢速冷凍沒有影響精子一些母源和父源印記基因、重複序列，及與精子生成和男性不孕相關的特異性基因的甲基化模式 ［２２ ］ 。相反，玻璃化冷凍精子和低溫貯存精子可造成精子ＤＮＡ 損 傷 及 一 些 男 性 特 異 性 基 因 和 印 記 基 因ｍＲＮＡｓ 的表達［ ２３ ］ 。

３ 卵子體外成熟

正常排卵的女性 ［２４ ］ 和多囊卵巢的女性 ［ ２５ ］ ，當其卵子經過體外非刺激性成熟培養後，與 ＩＶＦ 或 ＩＣＳＩ週期的標準超數排卵相比，均會表現出較低的胚胎移植率和臨床妊娠率。多囊卵巢的女性卵子經過體外成熟培養後，也會表現出較低的活產率 ［２５ ］ 。卵子體外成熟引起的不良影響，可能與體外成熟培養期間基因印記標記紊亂、基因轉錄異常和蛋白合成異常有一定的聯絡。研究發現，與體內成熟的卵子相比，體外成熟培養的 ＭⅡ 期卵子儲存的基因轉錄本發生了改變，而這些轉錄本與減數分裂、細胞週期調控及細胞蛋白代謝過程具有相關性 ［２６ ］ 。此外，一項關於恆河猴的研究認為，未經 ｈＣＧ 處理的體外成熟培養的卵子與經過ｈＣＧ處理的體內成熟卵子相比，兩組卵細胞中的轉錄本水平僅有微小的差異性 ［２７ ］ 。

４ 卵泡漿內單精子注射技術

儘管在一些男性和不 明原因的 不孕夫 婦中，ＩＣＳＩ相對於ＩＶＦ ，可以增加受孕率並降低受精失敗的風 險 ［２８ ］ 。但 是２０１０ 年 美 國 ＣＤＣ 公 布 的 關 於ＡＲＴ 總結報道中，認為從 ２００１ 至 ２０１０ 年期間，與無 ＩＣＳＩ 的 ＡＲＴ 週期相比， ＩＣＳＩ 週期的移植活產率一直表現為較低，在新鮮贈卵週期中，ＩＣＳＩ週期活產率是４５％ ～５５％ ，無ＩＣＳＩ的 ＡＲＴ 週期活產率是４９％～５７％ ，而在新鮮自身卵細胞移植週期中， ＩＣＳＩ週期活產率是 ３２％～３６％，無ＩＣＳＩ 的 ＡＲＴ 週期活產率 是 ３５％ ～３８％［ ２ ］ 。無 ＩＣＳＩ的 ＡＲＴ 周 期 和ＩＣＳＩ週期這兩組活產率的微小差別，可能的原因是用於 ＩＣＳＩ 的精子是源自精液異常的男性患者，這些精子基因或表觀遺傳修飾存在異常。這種異常的精子作用於 ＭＩＩ期卵子後可能會導致形成的胚胎表觀遺傳修飾缺陷，從而降低了ＩＣＳＩ週期的活產率。但是關於ＩＣＳＩ本身是否會引起胚胎表觀遺傳發生改變，有關這方面的研究結果尚存在較大的爭議。

５ 胚胎體外培養系統

一篇隨機對照試驗的系統綜述仍沒有確定出哪種胚胎培養基可以保證得到最好的 ＡＲＴ 臨床結局 ［３３ ］ 。而且在被納入分析的研究中發現，在不同的培養基質之間，其相應的臨床妊娠率存在超過 ５％的差異，這也說明了選擇良好的培養基對於 ＩＶＦ 或ＩＣＳＩ 週期成功率是有必要的。在移植前階段，人類囊胚處於不適宜的培養環境中，其全基因組表達模式會受到干擾 ［３４ ］ 。但是在對小鼠的實驗中，研究者發現小鼠胚胎儘管經過不適宜的培養基培養，但是其產生的子代仍是健康的，因此認為胚胎培養基可能不會對所有胚胎的全基因組表達產生干擾 ［３５ ］ 。