KRAS：作為非小細胞肺癌靶點的科研歷程

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前言

2021年5月28日，美國FDA宣佈加速批准安進（

Amgen

）公司開發的Lumakras（

sotorasib，AMG510

）上市，用於治療腫瘤攜帶KRAS G12C突變的非小細胞肺癌（

NSCLC

）患者。這些患者至少接受過一種前期全身性治療。這是全球範圍內首款靶向KRAS蛋白的抗腫瘤藥物。

Lumakras是由安進公司開發的一款“first-in-class”的KRASG12C突變體抑制劑，

Lumakras的獲批上市距離安進公司提交新藥上市申請（

NDA

），僅僅6個月。

AMG510結構

RAS基因被發現是腫瘤中最常見的突變基因之一，30%的腫瘤攜帶RAS變異，如果算上RAS調控因子和訊號通路上下游的變異，幾乎覆蓋所有腫瘤，RAS變異每年造成一百萬以上的病人死亡，無愧是腫瘤基因之王。這也令人非常好奇，RAS到底具有什麼神奇功能，令腫瘤細胞如此依賴？

KRAS的發現史

RAS是第一個被發現的人類腫瘤基因（

oncogene

）。

KRAS基因的全名叫Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog，翻成中文是“Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物”。KARS基因編碼的蛋白是一種小GTP酶（

smallGTPase

），它屬於RAS超蛋白家族。

19世紀末，巴斯德等巨匠的研究讓現代醫學在抗感染領域獲得巨大成功。1876年，一個俄羅斯人成功地將腫瘤組織從一隻狗移植到另外一隻狗。1908年，兩個丹麥科學家發現母雞白血病細胞中的提取物可以讓其它鳥類感染白血病。這些觀察和研究讓人們相信腫瘤也是病毒所致的傳染病。

1910 年，洛克菲勒研究所的 PeytonRous 從一隻來自紐約長島的母雞中發現了第一個腫瘤病毒 Roussarcomavirus（

RSV，勞氏肉瘤病毒

）。此後，一系列導致動物腫瘤的 RNA 和 DNA 病毒相繼被發現。致病機理也得到了合理地解釋：這些病毒（

RNA病毒透過逆轉錄酶

）可以將腫瘤基因整合到被感染的宿主細胞中，誘導惡變並維持腫瘤細胞的無限分裂。發現RSV的PeytonRous和發現RNA病毒逆轉錄酶的HowardTemin分別獲得1966年和1975年的諾貝爾生理醫學獎。至此，人們深信腫瘤是一種病毒導致的疾病。

直到1974年，UCSF 的 J。MichaelBishop 和他的博士後 HaroldVarmus 透過 DNA 探針意外發現未被感染的正常細胞中也存在此前 RSV 病毒中發現的腫瘤基因 src。原來腫瘤基因早就存在於宿主的基因組當中，遠古時期，病毒從宿主細胞中獲得這些基因片段並加以改造，也就是說病毒所攜帶的腫瘤基因其實來自我們自身。這些發現打開了以基因變異為基礎的現代腫瘤生物學的大門。Bishop 和 Varmus 也因此在 1989 年獲得了該領域的第三個諾貝爾獎。

Harvey 和 Kirsten 等人在 60 年代分別發現了類似於 RSV 的逆轉錄病毒攜帶的老鼠腫瘤基因 HRAS 和 KRAS。1982 年，Weinberg 等實驗室在人類膀胱癌細胞T24/EJ中也發現了HRAS，使得RAS成為第一個被發現的人類腫瘤基因。

KRAS基因及其相關通路

1. KRAS基因的分類

在人的基因組中，有 2 個 KRAS 基因。一個是 KRAS1，位於第6號染色體的短臂上；另一個是 KRAS2，位於第 12 號染色體的短臂上。其中，KRAS1 是“假基因”，不能被轉錄成 RNA，所以它是沒有功能的。而KRAS2才是“真基因”，能夠轉錄、並且翻譯成蛋白，具有生物學

活性。通常公司和文獻報道中所研究的KRAS基因和蛋白，是指“KRAS2”基因及其蛋白產物。

KRAS基因屬於RAS基因家族。RAS基因家族當中，還有NRAS （

neuroblastoma-RAS

）和HRAS （

Harvey-RAS

）。

2. KRAS蛋白的結構和位置

KRAS蛋白質有188個氨基酸，它的分子量是21。6KD。擁有GTPase酶活性的鳥嘌呤核苷結合蛋白。

KRAS蛋白定位在細胞膜的內側，透過一個法呢醯基（

Farnesyl

）的修飾基團【1】，連到細胞膜上。法呢醯基，是透過翻譯後的蛋白修飾，在法呢醯基轉移酶【2】的作用下，加到KRAS蛋白上的【3】。

3. KRAS相關通路

正常細胞中，細胞膜上的EGFR、HER2、ErbB3和ErbB4等受體單體與細胞膜外配體結合形成二聚體，二聚體自身磷酸化，再磷酸化下游的訊號蛋白。其中一條訊號通路可啟用Grb2-Shc，再啟用SOS蛋白，進而可啟用KRAS蛋白。

在細胞內，KRAS蛋白在失活和啟用狀態之間轉變，當KRAS與鳥嘌呤核苷二磷酸（

GDP

）結合時，它處於失活狀態，當它與鳥嘌呤核苷三磷酸（

GTP

）結合時，它處於啟用狀態，並且可以啟用下游訊號通路。

大部分細胞中的KRAS處於失活狀態，當它被啟用後，可以啟用多條下游訊號通路，其中包括MAPK訊號通路，PI3K訊號通路，和Ral-GEFs訊號通路。這些訊號通路在促進細胞生存、增殖和細胞因子釋放方面具有重要作用。

4. KRAS活性的調節因子

KRAS在失活與啟用狀態之間的轉換受到兩類因子的調節。

一類是鳥嘌呤核苷酸交換因子（

GEF

），這類蛋白催化KRAS與GTP的結合，從而促進KRAS的啟用，其中包括SOS蛋白（

屬GEFs/鳥苷釋放因子/鳥苷酸交換因子

）。

另一類是GTP酶（

GTPase

）啟用蛋白（

GAPs

），這類蛋白能夠促進與KRAS結合的GTP水解成為GDP終止活性狀態，從而抑制KRAS的活性。

KRAS致癌基因的突變

由於 RAS 在許多重要細胞訊號網路的軸上處於中心位置，因此它們與許多癌症標誌有關。

RAS是人類癌症中最常出現突變的致癌基因，目前已經在所有人類腫瘤的大約1/5中發現了突變引起的RAS蛋白啟用。

在KRAS的基因突變中，97%是第12號或者第13號氨基酸殘基發生了突變。

其中最主要的是G12D、G12V、G13D這三種突變。

結構學研究表明，這些基因突變大多幹擾KRAS水解GTP的能力。

KRAS基因的三種主要突變

為什麼說KRAS是“不可成藥“靶點？

既然KRAS如此重要，且KRAS基因上的致癌突變十分清楚，那麼，為什麼到現在為止，仍未上市一個直接針對KRAS基因的靶向藥物？

原因在於KRAS蛋白是一種

無特徵、近乎球形的結構，無明顯結合位點

，很難合成一種能靶向結合並抑制其活性的化合物。

長期以來無法攻克，KRAS已成為腫瘤藥研發領域“不可成藥”靶標的代名詞。

困難點在於：

1） KRAS的作用泛圍很廣，KRAS的正常活性也是許多正常細胞功能所需要的活性，如選取直接抑制KRAS的藥物，則該藥物毒性可能會很大，副作用也可能會很強。且KRAS與NRAS、HRAS有很高的同源性，能抑制KRAS活性的藥物，就很可能會抑制NRAS、HRAS的活性。那麼，這個藥物的毒性就可能很大。

2） 目前已知的KRAS的活性功能域，主要是KRAS與GDP、或GTP結合的口袋狀的功能域。與蛋白激酶與ATP的親和力較弱不同， KRAS與GTP、或GDP的結合非常強，親合係數達到PicoMolar（

皮摩爾濃度，10^-12

）級。而正常細胞裡面的GDP與GTP的濃度，達到了MicroMolar（

微摩爾濃度，10^-6

）級。所以，細胞內正常的GDP與GTP的濃度，比與KRAS結合所需的濃度，高了10的6次方倍。而RAS缺乏足夠大的能夠結合小分子的口袋；故要做出一種小分子化合物，其與KRAS的結合能力，要能與GDP、或者GTP相匹敵，非常難。

3） 設計一種只針對性抑制突變KRAS蛋白的活性藥物，而儘量少影響正常KRAS蛋白的活性，需要此種化合物對突變的KRAS有很好的選擇性。這是藥物設計的又一個難題。

4） 然而，間接靶向KRAS的策略也是困難重重，包括阻斷KRAS細胞膜定位和靶向KRAS下游的訊號分子，如RAF、MEK、ERK和PI3K等家族成員。具體而言，間接途徑的困難包括：（1）RAS是正常細胞生長和存活相關的必需途徑，靶向必需途徑首先面臨嚴重的毒副作用，導致療效指數非常狹窄甚至沒有；（2）補償逃逸機制，以及（3）由於嚴格調節導致的訊號反饋和冗餘。

展望

近年來，針對KRAS突變體的共價抑制劑研究的突破讓透過異構位點（

allosteric

）靶向KRAS突變體成為可能。在KRASG12C突變體中，與突變生成的胱氨酸共價結合的小分子更傾向與和GDP結合的KRAS蛋白相結合。而這一結合降低GTP與KRAS的親和力，同時阻礙GEF催化GTP替換GDP，將KRASG12C突變體鎖死在失活狀態。KRASG12C突變體上這一結合“口袋“的發現催生了多款靶向KRASG12C突變體的小分子共價抑制劑。

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