國科風教你單細胞測序（17）：文獻解讀（一）

大家好！我是國科東方綠豪克，我是生命科學方向的博士。

本期單細胞文獻解讀的是植物中的一篇文獻，2019 年 4 月 5 日發表於 Science ，題為“Defining the developmental program leading to meiosis in maize”的單細胞轉錄組文章。該文章透過單細胞轉錄組測序解釋了玉米減數分裂的程序。

首先做一個文章簡介，我們都知道減數分裂，減數分裂是有性生殖生物在生殖細胞成熟過程中發生的特殊分裂方式。在這一過程中，DNA 複製一次，細胞連續分裂兩次，結果形成的 4 個子細胞的染色體數目只有母細胞的一半。

減數分裂對生物的遺傳和變異起著很重要的作用，基本的過程劃分為四個階段：間期Ⅰ、減數分裂Ⅰ、間期Ⅱ和減數分裂Ⅱ（如下圖所示）。雖然從形態學劃分了減數分裂的幾個時期，但是減數分裂卻是一個很複雜的過程，對於植物細胞進入減數分裂的機制還是不清楚，也就是說，減數分裂過程中基因的表達變化是什麼樣的還是不太明確。

另外，玉米的花葯細胞會在缺氧的條件下會被誘導，從而使體細胞轉變為孢子細胞，該細胞為減數分裂的起始細胞。經過3天級聯有絲分裂後，孢子細胞開始成為花粉母細胞，從而進入減數分裂前期。

如下圖所示，減數分裂前期和早期細胞形態發生了改變，當然基因也發生了變化，但是這些事件發生的時間以及與減數分裂染色體階段的關係還是不清楚。在前減數分裂孢子細胞分化過程中是否存在具有不同基因表達的中間細胞階段？表達的巨大變化是減數分裂前期開始的訊號嗎？那麼本研究針對這兩個科學問題，利用單細胞轉錄組技術重塑了玉米雄性細胞進入減數分裂的發展過程，明確了減數分裂過程中基因表達的變化過程，從而能夠根據基因表達的變化來指示發育過程的轉變。

那麼我們看看本文是怎麼做的，在此我先把結果給大家展現，然後再把具體的流程總結。

首先，單細胞的取材是一個重要的技術活，需要最佳化條件得到較優質的雄性生殖細胞。如下圖 A 所示，這是玉米花葯早期的發育簡圖，從中可以看出玉米雄性生殖細胞形成於未成熟的花葯內，位於四個花葯裂片的中心。而花葯的長度是發育階段和器官年齡的可靠指標，鑑於此，單細胞主要從 0。3-1。5mm 的花葯細胞中進行分離。而圖 B 清晰的展現了該研究細胞分離和單細胞文庫構建的流程，在組織裂解為原生質體後，利用大小的區別將生殖細胞和花葯細胞分離出來，因為生殖細胞一般比花葯細胞的直徑大 2-4 倍。

完成單細胞分離後，進一步進行凍存（1-2h內，防止基因表達發生變異），然後將細胞樣品分裝為兩個試管，進一步進行細胞裂解，該操作可實現技術重複。透過這些操作，共從 24 株植株中分離得到 144 個生殖細胞，涵蓋了孢子細胞分化到減數分裂前期（粗線期）約1周的發育時間，進行建庫分析後，平均每個細胞檢測到 101245 個轉錄本。由圖C主成分分析結果可知，花葯長度的大小與細胞型別緊密相關，同時也發現技術重複具有很高的一致性，達到 0。92。

在 Figure1 中，除了取材，還進行了大量的文庫構建和單細胞分析工作。所以我們看一下方法和材料部分，可以發現單細胞文庫構建是基於 CEL-seq2 的工作流程。如下圖所示，我們前期也分享過，CEL-seq2 利用帶有唯一條形碼的引物在單管中對每個細胞進行逆轉錄。注意，此處的 UMI 由 6 增加到 10。

具體的建庫實驗操作如下：

那麼我們更關心的分析方法流程也如我們前面流程介紹，首先是 Library mapping （Hisat 2 比對 reads 到 B73 基因組），然後是 QC 質控，接著是測序資料的標準化，最後是計算偽時間和偽時間速度。基本流程大同小異，但是在進行這些操作時還需根據自己需求調整引數，而且該研究也運用多個R包進行同一流程的操作，互相比較得到較優的實驗分析結果。部分分析流程如下：

下期我們將對分析結論和文章總結進行呈現，未完待續……

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