無核品種中葡萄18號胚挽救技術體系的建立及其雜交後代早期選擇

摘要:

【目的】

無核品種是葡萄的主要育種目標之一，透過建立無核品種中葡萄18號的胚挽救技術體系，為無核葡萄的胚挽救育種提供參考依據。

【方法】

透過研究不同胚珠取樣時間（盛花後52、53、54、57、58、61和65d，DAF），培養基型別（NN和ER）及相態（固-液雙相和固相），氨基酸（0，2。5mmol·L-1Ser、Cys、Gln），椰汁（0、100、200mL·L-1），GA3/KT/NAA組合及4種細胞分裂素TDZ（0和0。2mg·L-1）、6-BA（0和0。2mg·L-1）、KT（0、0。2和0。4mg·L-1）和ZT（0、0。2和0。4mg·L-1）對中葡萄18號胚發育率、胚萌發率或成苗率的影響，並利用無核基因SSR標記對胚挽救雜種苗進行無核性狀早期鑑定，初步建立該品種的胚挽救技術體系。

【結果】

中葡萄18號在DAF61取樣時胚發育率最高（34。33%）；基本培養基NN（29。33%）較ER（25%）的胚發育率更高，且固-液雙相培養基的效果較固相更佳；新增2。5mmol·L-1Ser（40。74%）、Cy（s43。33%）或Gln（44。21%）的胚發育率均高於對照（29。33%）；新增200mL·L-1椰汁的胚發育率（37。10%）顯著高於對照（29。33%）。在3種激素GA3/KT/NAA組合中，發現僅新增GA3和KT時，成苗率最高（60%），而新增NAA的組合均出現異常分化現象，且成苗率較低。四種細胞分裂素TDZ、6-BA、KT和ZT中，新增0。2mg·L-1ZT更適合胚萌發及成苗，正常成苗的比率達76。36%。分別利用無核SSR標記P3_VvAGL11和5U_VviAGL11對中葡萄18號×玫瑰香的406個雜交株系進行無核性狀檢測，初步判定229個後代為無核株系，該組合的無核率為56。4%。

【結論】

中葡萄18號作為胚挽救母本的最佳取樣時間為DAF61前後，可利用固-液雙相培養基NN+2。5mmol·L-1Cys/Gln+5。5g·L-1瓊脂+60g·L-1蔗糖+2g·L-1活性炭+0。5g·L-1水解酪蛋白進行胚珠離體培養，暗培養9~10周後，接種裸胚於WPM+0。2mg·L-1ZT+20g·L-1蔗糖+6g·L-1瓊脂+1g·L-1活性炭進行胚萌發培養。鑑定出擁有無核基因SSR標記的胚挽救苗229株，是潛在的無核葡萄新種質。

果實無核是一種優良性狀，無核葡萄深受消費者喜愛，在世界鮮食葡萄市場佔據著重要的地位。目前，市場上獲得葡萄無核果的途徑主要有兩種：一是利用外源激素對有核品種進行無核化處理；二是利用常規雜交或胚挽救技術等方法培育無核葡萄品種。儘管生產上無核化技術已得到廣泛應用，但考慮到安全、經濟等問題，化學物質誘導葡萄無核化終將會被綠色安全的無核品種所取代。然而，現有無核品種無法滿足生產和消費者的需求，因此無核品種的培育成為葡萄育種領域研究的熱點。

目前，無核葡萄品種大多源於歐美（美國、法國、義大利、德國和西班牙等）、澳洲及亞洲部分國家（日本、以色列等）。與國外相比，我國選育的擁有自主智慧財產權的無核品種較少，且育種速度緩慢。無核葡萄胚挽救技術的出現，逐漸改變了這一現狀。1983年，美國育種家Cain等利用胚珠離體培養進行無核葡萄胚挽救，成功獲得胚挽救苗。據Ram-ming等研究，胚挽救技術可使雜交後代的無核率達到82%，且與傳統育種相比，育種週期至少縮短5a。胚挽救技術是對合子胚敗育之前的胚珠進行離體培養，包括3個階段：胚發育、胚萌發和成苗階段。目前，胚挽救技術日趨成熟，但在實際應用中，胚發育率及成苗率仍受到很多因素的影響，如親本基因型、取樣時期、培養基的型別及新增成分、培養條件等。因此，仍有必要對無核葡萄胚挽救技術進行深入研究。此外，由於葡萄童期較長，而無核表型只能在成年植株中篩選，因此利用無核基因分子標記對胚挽救幼苗進行早期輔助選擇，可以提高無核葡萄的育種效率。筆者在本研究中利用品質優良的無核新品種中葡萄18號，透過探討影響該品種胚挽救的因素，並利用無核基因SSR標記對胚挽救雜交後代進行無核性狀早期選擇，以建立中葡萄18號的胚挽救技術體系，為今後開展無核葡萄胚挽救育種提供參考依據。

一、材料和方法

1.1材料

供試材料為中葡萄18號（V。viniferaL。‘Zhong-putaoNo。18’）×玫瑰香（V。viniferaL。‘MuscatHam-burg’）雜交胚珠及中葡萄18號自然授粉胚珠。中葡萄18號為2020年中國農業科學院鄭州果樹研究所選育的無核葡萄品種，親本為無核紫×玫瑰香，具有中晚熟、果粒大、殘核、果實耐貯運、豐產性及抗逆性強等特點，適於鮮食和制幹。本試驗於2020年4月—2021年3月在鄭州果樹研究所新鄉綜合試驗基地、鄭州果樹研究所實驗室完成。

1.2胚挽救技術的操作流程

1.2.1田間雜交授粉

當年在父本初花期時收集花粉，乾燥後裝瓶密封，貯存於4°C備用（圖1-A~B）。5月初，在母本開花前3~4d去雄。去雄後，立即套袋，並標記品種名及去雄日期（圖1-C~D）。去雄後2~3d，在雌蕊柱頭上出現黏液時，於上午7：00—9：00進行授粉，連續授粉3d（圖1-E）。

1.2.2胚挽救程式

中葡萄18號授粉後約50d取雜交果穗，剪下果粒置於大燒杯中，用乾淨的網兜罩住，流水沖洗2~4h。果粒殺菌消毒：75%（φ，後同）乙醇浸泡30s→無菌水漂洗1次→現配的0。1%昇汞溶液浸泡5min，期間晃動燒杯數次→無菌水漂洗3次。在無菌條件下，剝取胚珠（圖1-F），將長度>2mm的胚珠接種至胚發育培養基，進行暗培養（圖1-G~H）。9周後，剖取胚接種於胚萌發培養基進行光照培養（圖1-I~J），期間統計發育胚數、胚發育率。培養30d後統計胚萌發數、胚萌發率，45d後統計成苗數、成苗率（圖1-K~L）。胚發育率/%=發育胚數/接種胚珠數×100；胚萌發率/%=胚萌發數/發育胚數×100；成苗率/%=正常成苗數/發育胚數×100。

胚挽救苗進行繼代增殖（MS+0。6mg·L-1IBA+0。1mg·L-16-BA+20g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂，pH=5。85）及生根培養（1/2MS+0。3mg·L-1IBA+20g·L-1蔗糖+7。2g·L-1瓊脂，pH=5。85）。春季選擇生長健壯，葉色濃綠，根系發達的雜交幼苗進行煉苗（圖1-M~O）。

1.3確定最佳取樣時間

2020年5月17日盛花，取樣時間是指盛花後的天數（daysafteranthesis，DAF）。為探討取樣時間與不同發育時期胚珠縱橫徑及單粒質量的變化之間的關係，分別在DAF16、19、22、26、29、33、36、43、45、51、54、57、61、65和68上午9：00左右採集中葡萄18號（自然授粉）的果實，置於冰盒帶回實驗室。剝離胚珠，隨機選擇10粒胚珠，用萬分之一天平稱其總質量，數顯遊標卡尺測量其縱徑、橫徑，並計算單粒的質量、縱徑及橫徑，3次重複。對每個變數進行方差分析，並採用Duncantest進行差異顯著性分析（p<0。05）。

A、B。收集父本花粉；C。去雄；D。套袋，做標記；E。人工授粉；F。採集幼果，剝取胚珠；G、H。胚珠培養；I。剖取幼胚；J。胚培養；K。胚萌發；L。成苗；M~O。煉苗移栽。

分別採集DAF52、53、54、57、58、61和65中葡萄18號（自然授粉）漿果。剝取胚珠接種至固相培養基NN+5。5g·L-1瓊脂+60g·L-1蔗糖+2g·L-1活性炭（AC）+0。5g·L-1水解酪蛋白（caseinhydrolysate，CH）+100mL·L-1椰汁上。3次重複，每個重複至少接種4皿（9cm×9cm培養皿），每皿15個胚珠。記錄胚發育率/%=發育胚數/接種胚珠數×100，並用皮爾遜相關係數（PearsonCorrelationCoefficient）檢驗兩變數之間的相關性（p<0。05）。

1.4不同培養基及新增

物對胚發育的影響

為研究培養基相態對胚發育的影響，分別採用固相、固-液雙相NN+100mL·L-1C（JN1）培養中葡萄18號×玫瑰香的雜交胚珠，固相、固-液雙相MM（MM3［9］培養基的大量元素+ER的微量元素+MS的鐵鹽+ER的有機物質）培養中葡萄18號自然授粉的胚珠，附加0。5g·L-1CH+5。5g·L-1瓊脂+60g·L-1蔗糖+2g·L-1AC，其中液相部分約為5mL且不加瓊脂。採用獨立樣本T檢驗進行顯著性分析（p<0。05）。

為比較不同培養基對胚發育的影響，將中葡萄18號×玫瑰香的雜交胚珠接種至基本培養基NN［10］和ER［11］上。附加0。5g·L-1CH+5。5g·L-1瓊脂+60g·L-1蔗糖+2g·L-1AC，所用NN、ER培養基均購自北京酷來搏（Coolaber）科技有限公司。採用配對樣本T檢驗進行顯著性分析（p<0。05）。

為探討椰汁和氨基酸對胚發育的影響，在胚發育培養基（NN+0。5g·L-1CH+5。5g·L-1瓊脂+60g·L-1蔗糖+2g·L-1AC）上，分別新增0、100、200mL·L-1ye zhi椰汁（coconutjuice，CJ），2。5mmol·L-1Ser、Cys或Gln培養中葡萄18號×玫瑰香的雜交胚珠。

1.5外源激素對胚萌發的影響

為篩選出最適宜胚萌發成苗的植物生長調節劑，以WPM+20g·L-1蔗糖+6g·L-1瓊脂+1g·L-1AC（pH=5。8~5。9）為基本培養基，附加不同的外源激素。首先，參照均勻設計U（773），將GA3、KT、NAA3種激素組合，各因子均為7個水平，其中GA3的質量濃度梯度為0、0。1、0。2、0。3、0。4、0。5、0。6mg·L-1，KT和NAA的質量濃度梯度為0、0。2、0。4、0。6、0。8、1。0和1。2mg·L-1。此外，比較4種細胞分裂素TDZ（0和0。2mg·L-1）、6-BA（0和0。2mg·L-1）、KT（0、0。2和0。4mg·L-1）、ZT（0、0。2和0。4mg·L-1）對胚萌發成苗的作用。30d後統計胚萌發率，45d後統計成苗率，分析有利於胚萌發成苗的激素種類及其質量濃度範圍。對各變數進行方差分析，並採用DuncanTest進行差異顯著性分析（p<0。05）。

1.6無核基因分子標記輔助選擇

高通量提取胚挽救親本及雜種株系的葉片基因組DNA，具體方法參照張南南等［12］。分別利用葡萄無核基因SSR標記P3_VvAGL11的引物（F：5’-CTCCCTTTCCCTCTCCCTCT-3’；R：5’-AAACGC-GTATCCCAATGAAG-3’）和5U_VviAGL11的引物（F：5’-CGCCCATTCTCTCTCGCTAT-3’；R：5’-GT-GCAAAAACGCGTATCCCA-3’）對雜交組合親本及後代進行PCR擴增［8，13］，然後對擴增產物進行8%（w）聚丙烯醯胺凝膠（PAGE）電泳檢測，依據P3_VvAGL11和5U_VviAGL11的無核等位基因187bp、306bp的存在與否，初步判定無核株系。

在筆者課題組的研究中，在SSR標記P3_VvA-GL11和5U_VviAGL11位點上，母本中葡萄18號的基因型分別為177：187和298：306，父本玫瑰香的基因型分別為163：177和272：294（未發表）。

1.7資料處理

所有試驗均採用完全隨機設計，每次試驗3次重複。利用Excel進行資料整理，使用SPSS23。0進行資料分析，使用Excel2019，Origin2021進行繪圖。

二、結果與分析

2.1胚挽救雜種後代的獲得

2020年對2個組合進行胚挽救，其中中葡萄18號×玫瑰香接種1717個雜交胚珠，獲得發育胚566個，成苗363株；自然授粉的中葡萄18號接種2189個雜交胚珠，獲得發育胚572個，成苗181株（表1）。

2.2最佳取樣時間的確定

2.2.1中葡萄18號的胚珠縱橫徑及單粒質量變化

隨著中葡萄18號的生長髮育，其胚珠縱、橫徑與單粒質量均在發育前期呈顯著增加，達到較大值後趨於平緩，之後顯著下降（圖2）。胚珠發育到36d時，其縱橫徑及單粒質量均達到一個較大值；在36~61d，大致維持穩定；61d後開始下降。

2.2.2取樣時間對胚發育的影響

以中葡萄18號為母本，約在DAF61接種胚珠時，胚發育率最高，為34。22%（圖3）。DAF61前的胚發育率呈上升趨勢，可能是由於胚的發育程度不斷提高；而DAF61後，其胚發育率呈下降趨勢，推測DAF61後胚逐漸發生自然敗育。皮爾遜相關係數分析表明，中葡萄18號的取樣時間與其胚發育率呈顯著相關（|r|=0。777，p<0。05）。

2.3培養基相態對胚發育的影響

將中葡萄18號×玫瑰香的胚珠分別接種至N1固相和固-液雙相培養基上，其胚發育率分別為20。50%和37。58%；將中葡萄18號自然授粉的胚珠分別接種至MM固相和固-液雙相培養基上，其胚發育率分別為23。89%和30。41%。結果表明，固-液雙相培養基上的胚發育率均顯著高於固相培養基（表2）。

2.4培養基不同組分對胚發育的影響

2.4.1基本培養基對胚發育的影響

中葡萄18號×玫瑰香的胚珠分別接種到NN和ER培養基上。結果表明，NN培養基上的胚發育率（29。33%）高於ER培養基（25。00%）（表3）。

2.4.2氨基酸對胚發育的影響

將中葡萄18號×玫瑰香的胚珠接種到胚發育培養基上，在NN培養基中新增2。5mmol·L-1Gln的胚發育率最高，達44。21%（A7），高於對照29。33%（A3），說明Gln能促進中葡萄18號的胚發育。新增Se（rA5，40。74%）或Cy（sA6，43。33%）的胚發育率也高於對照，但略低於Gln，表明不同氨基酸均可促進胚發育，但效果略有差異，其中新增Gln更有利於胚發育（表3）。

2.4.3椰汁對胚發育的影響

在NN培養基中新增不同體積分數的椰汁（CJ），結果顯示，新增200mL·L-1椰汁的胚發育率達到37。10%（A2），高於對照，表明椰汁能促進胚的發育。此外，在NN培養基中新增0。5g·L-1CH（A3）或100mL·L-1椰汁（A4），其中新增椰汁的胚發育率（31。76%）略高於CH（29。33%），可能是由於椰汁提供了更多的營養成分（表3）。

2.5外源激素對胚萌發成苗的影響

2.5.1GA3/KT/NAA組合對胚萌發成苗的影響

將中葡萄18號的雜交胚接種至以WPM為基礎的胚萌發培養基中，分別新增7種不同的GA3/KT/NAA組合。結果表明，當GA3/KT/NAA為0。4/1。0/0。0mg·L-1（J6）時，胚萌發成苗率最高（60%），顯著高於其他組合（表4）。在新增NAA的培養基中，根莖葉出現異常分化現象，即大多數胚可以萌發，但基本僅分化出根，不分化或分化極少的莖葉（圖4）。只有在NAA質量濃度較低的J4（GA3/KT/NAA為0。1/0。2/0。2mg·L-1）中，成苗率達37。74%，遠高於NAA質量濃度為0。4、0。6、0。8、1。0、1。2mg·L-1的培養基（表4）。結果表明，GA3和細胞分裂素有利於胚萌發成苗，而高濃度NAA不利於中葡萄18號胚的正常萌發。

2.5.24種細胞分裂素對胚萌發成苗的影響

將中葡萄18號的雜交胚分別接種至含不同細胞分裂素（TDZ、6-BA、KT和ZT）的胚萌發培養基中。結果顯示，新增0。2mg·L-1TDZ時，胚萌發率最高（79。38%），但其成苗率較低，僅為69。07%；含有0。2mg·L-16-BA、KT、ZT，0。4mg·L-1ZT的胚萌發培養基與對照（T1）相比，萌發率略有差異，但差異不顯著。新增0。2mg·L-1ZT時，胚成苗率最高，且與其他6個處理的成苗率差異顯著，其成苗率和胚萌發率均為76。36%（表5）。綜上所述，在WPM培養基中新增0。2mg·L-1ZT，最適合胚的萌發及正常成苗。

2.6無核基因分子標記對雜交後代的早期選擇

利用無核基因分子標記P3_VvAGL11對中葡萄18號×玫瑰香的406株雜交幼苗進行檢測，發現223個株系擴增出無核特異條帶187bp，初步判斷以上223個株係為無核表型（圖5）。

利用無核基因分子標記5U_VviAGL11對406株雜交幼苗進行檢測，發現215個株系擴增出無核特異條帶306bp，初步判斷以上215個株係為無核表型（圖6）。

綜合2個標記的檢測結果，發現其中209個株系同時被2個無核SSR標記檢測為無核，另外20株由P3_VvAGL11或5U_VviAGL11檢測為無核，故初步判定229株中葡萄18號×玫瑰香的雜交子代為無核株系，該組合的無核率為56。4%（圖7）。

三、討論

在無核葡萄胚挽救過程中，影響胚發育率和成苗率的因素有很多，如親本基因型、取樣時期、胚珠離體培養時間、培養基組分、培養方式等。

取樣時期決定雜種胚珠內胚的發育程度，取樣過早或過晚均會對胚挽救造成影響。李桂榮等提出胚珠質量可作為確定最佳接種時期的參考指標，王飛等認為在胚珠發育停止前，質量和縱橫徑最大且胚發育為心形胚時，無核葡萄進行胚挽救容易成功。筆者在本研究中發現中葡萄18號不同發育階段的縱橫經及單粒質量均在發育前期呈現顯著增加，在DAF36~DAF61期間趨於平緩，之後顯著下降，推測胚挽救的適宜取樣時間在DAF36~DAF61之間。進一步研究，發現胚發育率與取樣時期呈顯著負相關，這與Li等的研究結果一致，且DAF61的胚發育率最高，這與胚珠縱橫徑及質量的變化所得結果基本一致。綜上，筆者認為可以先透過胚珠縱橫徑及質量變化大致確定取樣範圍，再依據盛花後不同時間的胚發育率來確定最佳取樣時間。

胚發育培養基為離體胚珠提供了幼胚發育所需的營養物質，直接影響到胚的存活及進一步的發育，是胚挽救的關鍵。基本培養基透過提供必需的營養物質來調節植物組織的生長和形態，其鹽配方至關重要。目前，常用NN、ER培養基進行胚珠培養。Ebadi等研究表明，NN比ER培養基更適合FlameSeedless的胚發育。程琳琳等和郭豔芳等發現NN比ER培養基更適合紅寶石無核的胚培養。在本研究中，NN比ER培養基更利於中葡萄18號的胚發育，這與前人研究結果一致。然而，Tian等對EmeraldSeedless×Beichun的雜交胚珠進行培養，發現ER培養基的效果優於NN，這可能是由於不同母本的胚發育程度不同，對培養基的成分及濃度要求不同。

培養基相態主要包括固體、液體和固-液雙相。前人研究表明固-液雙相培養基更利於胚發育。筆者在本研究中分別採用2類培養基的固相和固-液雙相進行胚珠培養，結果表明固-液雙相培養基上的胚發育率顯著高於固體培養基，這與前人研究結果一致。而李志瑛等研究表明，火焰無核×昆香無核、紅寶石無核×克瑞森無核在固體培養基上的培養效果顯著優於固-液雙相，昆香無核×新鬱在2種相態的培養基上無顯著差異。這種差別可能是由於操作中液相過多，氧氣供給不足影響到胚的正常發育。實際應用中，對於不同的基因型，應進行多次重複試驗，以找出適合的培養基型別。

培養基的組分對胚發育影響顯著。前人研究發現谷氨醯胺、天冬醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、脯氨酸等氨基酸可顯著提高胚發育率，促進胚發育和成苗。趙雅楠等認為醯胺類氨基酸可促進胚挽救成苗。筆者在本研究中在NN培養基上新增絲氨酸、半胱氨酸或谷氨醯胺進行胚珠培養，發現3種氨基酸的效果雖略有差異但均可促進胚發育，其中谷氨醯胺的效果最好。綜上，在進行胚挽救時，可新增一定的氨基酸用於胚珠培養，可優先採用醯胺類氨基酸進行試驗。椰子乳汁含有胚因子，對於心形胚甚至原胚的生長髮育具有顯著的作用。筆者本研究中在NN培養基+0。5mg·L-1水解酪蛋白的基礎上，探討椰汁對胚發育的作用，發現新增200mL·L-1椰汁可顯著促進胚的發育。但與新增2。5mmol·L-1谷氨醯胺相比，其胚發育率偏低。今後需進一步探討同時新增椰汁和氨基酸的胚發育情況，若差異不顯著，可透過新增氨基酸來促進胚發育。

外源激素的種類及配比是無核葡萄胚萌發及成苗的關鍵因素。GA3和IAA均能提高胚挽救成功率。外源細胞分裂素能打破胚休眠，在MS培養基上新增1μmol·L-1BA或5μmol·L-1玉米素均可刺激胚快速萌發。Singh等發現，在MS培養基上新增4mg·L-1IAA+0。5mg·L-1GA3最利於胚萌發。Li等在WPM培養基上新增5。7μmol·L-1IAA+4。4μmol·L-16-BA+1。4μmol·L-1GA3，胚萌發率和成苗率最高。賈姍姍等在WPM培養基上新增1。0mg·L-1KT+0。5mg·L-1NAA+1。0mg·L-1ZT，明顯促進胚萌發。Zhu等研究發現最適合胚萌發和成苗的培養基是WPM+0。2mg·L-16-BA+0。1mg·L-1IAA。在前人的研究中，細胞分裂素、GA3和生長素這3大類激素均可促進胚萌發成苗。筆者在本研究中以WPM為基本培養基，探討GA3/KT/NAA對成苗的作用，發現新增0。4mg·L-1GA3+1。0mg·L-1KT時成苗率較高，而新增NAA，尤其是濃度較高的組合，成苗率很低，出現異常分化現象，推測NAA濃度過高不利於中葡萄18號胚萌發成苗，也可能是內源生長素的量即可滿足胚的萌發成苗。Tian等和Li等研究表明，WPM+1μmol·L-16-BA最適於胚萌發成正常苗，可減少異常幼苗的發生，認為細胞分裂素可以透過影響內源生長素來促進胚萌發。基於此，筆者探討4種細胞分裂素對胚萌發成苗的作用，發現僅新增細胞分裂素就能達到較高的成苗率，其中0。2mg·L-1ZT的成苗率最高，且基本均可正常成苗；而在0。2mg·L-1TDZ或6-BA的培養基中，胚萌發率較高，但成苗率較低，發生的異常幼苗較多。綜上，推測萌發培養基中僅新增一定的細胞分裂素（CTK）即可提高胚挽救的成功率，其中0。2mg·L-1ZT的效果更佳，而GA3/CTK的配比需要進一步研究。

無核葡萄作母本進行胚挽救，可極大提高雜種後代中的無核比例。隨後的研究也證實了這一點，如Zhu等利用無核分子標記SCF27-2000對胚挽救後代進行檢測，發現無核品種×無核品種的後代無核率為89。9%~100%，無核×有核的後代無核率為83。3%~96。2%。Li等利用GSLP1-569對以火焰無核為母本的雜交後代進行檢測，顯示後代無核率分別為58。3%（塘尾）、60%（紅寶石無核）、67。2%（克瑞森無核）、80。4%（雙優）；昆香無核×塘尾（91。7%）的後代無核率高於火焰無核×塘尾（58。3%）。筆者利用無核SSR標記P3_VvAGL11和5U_VviAGL11檢測中葡萄18號×玫瑰香的雜交後代無核率為56。4%。檢測的後代無核率的差異，可能是分子標記的假陽性率造成的，也可能因為親本材料的無核傳遞力不同。所以在進行無核葡萄育種時，在保證胚挽救成功率的前提下，可選擇無核傳遞力較強的品種作親本，再選擇準確率及無核檢出率較高的分子標記進行雜交後代早期選擇。

四、結論

中葡萄18號作為母本進行胚挽救時，最佳接種時間為DAF61前後。胚發育階段，可利用固-液雙相培養基NN+2。5mmol·L-1Cys/Gln+5。5g·L-1瓊脂+60g·L-1蔗糖+2g·L-1活性炭+0。5g·L-1水解酪蛋白進行胚珠離體培養；暗培養9~10周後，剝取裸胚接種於固相WPM+0。2mg·L-1ZT+20g·L-1蔗糖+6g·L-1瓊脂+1g·L-1活性炭進行胚萌發培養。利用無核基因SSR標記對中葡萄18號×玫瑰香的胚挽救後代進行早期檢測，初步判定229個子代為無核表型，是潛在的無核葡萄新種質。

轉自“果樹學報”侵刪