病毒被清除了，但免疫細胞還是留下了記憶

背景介紹

即使病毒得到有效抑制，HIV感染者也常常表現出持續的低水平慢性炎症，這增加了心血管疾病和神經認知功能障礙的風險，影響患者的生存質量。

導致HIV感染者慢性炎症的一個可能原因是，感染病毒的細胞釋放包含Nef蛋白的外泌體（exNef），發揮促炎作用。另外，訓練免疫（trained immunity）機制也參與了慢性炎症的發生。

在本研究中，作者探究了暴露於exNef是否對巨噬細胞造成長期影響及其與隨後長期慢性炎症反應的關係。

研究內容

exNef

引起細胞反應性改變

為研究exNef對細胞反應性的影響，作者分離獲得人原代單核細胞，暴露於exNef 48h，培養6天至分化為單核細胞來源的巨噬細胞（monocyte-derived macrophages， MDMs），脂多糖（lipopolysaccharides， LPS）處理，分析MDMs細胞因子變化。結果顯示，與對照組相比，暴露於exNef後腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α， TNF-α）和白介素6（interleukin-6， IL-6）增加，細胞反應性升高。

滴定分析表明，隨著exNef濃度降低，對細胞反應性的影響遞減。

透過RNA-seq評估exNef處理後基因表達的變化，分析顯示，表達上調的基因主要集中於細胞因子與炎症通路，參與其中的基因主要有IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-10、IL-18、CXCL8和TNFα。

體外實驗分析exNef效應

與體外實驗類似，作者用C57BL/6J小鼠對exNef在體內的效應進行研究。結果顯示，exNef處理後，骨髓來源的巨噬細胞（bone-marrow-derived macrophages， BMDMs）中ABCA1的丰度較低，符合exNef的預期效應。分離質膜進行分析，exNef處理後脂筏增加。此外，細胞產生的TNF-α同樣顯著多於對照組。以上實驗現象提示，exNef處理後，髓系細胞可分化產生高反應性的巨噬細胞。

為進一步研究這一現象，作者透過骨髓移植，將exNef處理後的小鼠骨髓移植到輻照小鼠體內，一段時間後獲取BMDMs並用LPS處理，分析結果顯示ABCA1降低且TNF-α升高。由此推知，exNef誘導骨髓前體細胞形成長期記憶，進而影響BMDMs對炎症刺激的反應。

體內實驗分析exNef效應

MDMs分析

流式細胞術分析結果顯示，exNef處理後分化的MDMs亞群（根據marker表達水平區分）分佈發生改變，數量增加的類群均低表達CD16（M1巨噬細胞相關特徵），且多數高表達CD80、CD64、CD68及HLA-DR，這些結果表明，exNef處理單核細胞改變了其分化，使其向促炎方向轉變。

為研究exNef是否誘導了單核細胞的表觀遺傳修飾，透過ATAC-seq測序分析基因啟動子在開放染色質區域的定位變化，結果顯示發生變化的區域主要與炎症和膽固醇代謝通路相關。

MDMs分析

抑制膽固醇合成和IGF1R訊號通路影響訓練免疫

分析exNef處理後MDMs產生乳酸的情況，結果顯示exNef促進糖酵解。分析MDMs中幾種膽固醇合成限速基因的表達，結果顯示羥甲基戊二醯輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase， HMGCR）表達上調。單核細胞中膽固醇的生物合成很低，分化形成MDMs後，exNef處理組表現出更高的膽固醇合成速率。HMGCR抑制劑可抑制exNef誘導的訓練免疫，這驗證了膽固醇生物合成在exNef誘導訓練免疫中的作用。類似地，IGF1R訊號通路抑制劑鬼臼苦素（PPP）同樣可以抑制exNef的作用。

ExNef誘導訓練免疫的機制

exNef誘導訓練免疫中脂筏的作用

研究顯示，exNef增加了IGF1R染色和脂筏染色雙陽性的單核細胞百分比，且細胞中檢測到更多的Flotillin-1（脂筏相關蛋白）。綜上可知，exNef透過刺激膽固醇的生物合成和增加脂筏的丰度，啟用IGF1R訊號通路，進而誘導訓練免疫。

ExNef上調脂筏表達

主要結論

透過對exNef誘導細胞反應性改變的研究，作者認為攜帶HIV蛋白Nef的外泌體可引起宿主炎症反應的長期變化，其機制與訓練免疫有關，這是導致HIV感染者持續低水平慢性炎症的原因之一。

Dubrovsky L， Brichacek B， Prashant NM， Pushkarsky T， Mukhamedova N， Fleetwood AJ， Xu Y， Dragoljevic D， Fitzgerald M， Horvath A， Murphy AJ， Sviridov D， Bukrinsky MI。 Extracellular vesicles carrying HIV-1 Nef induce long-term hyperreactivity of myeloid cells。 Cell Rep。 2022 Nov 22；41（8）：111674。 doi： 10。1016/j。celrep。2022。111674。 PMID： 36417867。