單一混合蛋白質分離純化方法與質譜鑑定詳解

文章導讀

單一蛋白質樣品的分離、純化？

單一蛋白質的質譜鑑定？

蛋白質混合物質譜鑑定方法？

對於單一蛋白的常用鑑定方法，大家肯定立馬想到免疫印跡法（Western Blot）。Western Blot是透過抗體和目標分子的特異性結合從而對目標蛋白進行鑑定，但是這種方法是適用於對已知蛋白進行鑑定，並且必須藉助抗體，所以不適用於對未知或者沒有相應抗體的蛋白進行分析。那麼小夥伴們可能要問了，如果自己要研究的蛋白質是未知的或者目前沒有可用抗體怎麼辦呢？在這種情況下，就可以藉助質譜鑑定技術來對蛋白質進行鑑定了。在這期中小編就給大家整理了蛋白質鑑定的相關知識，希望對於蛋白質鑑定一直有困惑的同學能有幫助。

一、單一蛋白質分離純化

提到單一蛋白樣品，顧名思義在這類蛋白樣品應該已經經過了一定的蛋白純化步驟，獲得了相對單一的蛋白。通常透過細胞裂解或者體外合成的蛋白質都包含其他的雜蛋白，因此需要將目的蛋白與雜蛋白區分開，常用的蛋白分離純化方法便是電泳分離。一維電泳分離利用蛋白質大小不同的特性，能夠很好的將不同分子量的蛋白進行區分，另外，再次基礎之上二維電泳能夠進一步將不同帶點量的蛋白分子進行區分。

1。 一維電泳

目前普遍採用的一維電泳為垂直板聚乙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE膠），其原理是不同濃度的乙烯醯胺在聚合後會產生具有一定孔徑大小的凝膠，接著在緩衝液中加入SDS表面活性劑中和蛋白質表面的電荷，當變性的蛋白質混合樣品透過凝膠空隙的時候，不同分子量大小的蛋白質在凝膠中遷移的速度不同因而被分離開來。一維電泳能夠分離對大多數蛋白和蛋白質複合物進行初步分離。

圖1。 蛋白質一維電泳分離

2。 二維電泳

二維電泳，也稱為雙向電泳，是在一維電泳的基礎上加入了橫向的等電聚焦分離，而其縱向的分離與一維SDS分離方法完全一樣。二維電泳首先利用蛋白等電點不同的特性，對蛋白進行初步分離，接著再根據蛋白質分子量不同，再進一步對等電點相同或相近的蛋白質進行二維分離，進一步提升蛋白質分離效率。二維電泳的蛋白解析度相比一維電泳已經大幅度提升，經過二維電泳分離後大部分蛋白質都能夠被分離為含有單一的蛋白質蛋白膠點。

圖2。 蛋白質二維電泳分離

二、單一蛋白質鑑定

目前對純度較高，或單一蛋白質的鑑定的方法有蛋白質指紋譜鑑定（PMF）和MS/MS串聯質譜鑑定法。這兩種方法都是先將蛋白質酶切成多肽片段，再利用質譜儀對肽段分析，達到對蛋白質鑑定的目的。而兩種方法的不同之處就在於PMF法只使用一級質譜對蛋白肽段進行檢測，而MS/MS不僅經過一級質譜檢測，並且在此基礎上選取特定肽段進行肽段破碎，對肽段的序列進行測定。因此MS/MS比PMF的鑑定準確度更高，與資料庫比對的可靠性更高，但分析起來的也更為複雜。

1。 蛋白質指紋譜鑑定（PMF）

由於蛋白質序列的不同，因此不同的蛋白質在同一種消化酶的作用下酶切產生的多肽片段大小質量是特異的。蛋白質指紋譜鑑定法正是利用了每種蛋白酶切產生的太片段不同的特性，對純化的蛋白質進行酶切處理，再對酶切產生的肽片段的質量進行分析，即可獲得蛋白質的肽質量譜圖。再將肽譜圖與資料庫中蛋白質理論肽譜圖進行比對，進而可獲知蛋白質的身份資訊。

2。 MS/MS串聯質譜法

串聯質譜（MS/MS）檢測蛋白的原理是先使用一級質譜檢測肽段的質量資訊，再選取峰值高的肽段進行破碎，分析獲得二級質譜。用檢索軟體選擇相應的資料庫對質譜資料進行分析，同時以打分的形式評判鑑定結果，當打分大於某個閾值時，即判定質譜鑑定成功，反之則鑑定失敗。

三、蛋白混合物鑑定

雖然目前有多種蛋白質分離純化的方法，但在很多時候分離效率不夠高，導致分離後的蛋白可能還是含有多個蛋白。另外，對於丰度較低的蛋白質可能在分離過程中造成進一步損失而無法被鑑定到，因此需要直接對這一類蛋白質不經過分離處理直接進行分析。目前適用於對混合蛋白進行分析的方法有LC-MS/MS色譜質譜串聯分析法。與PMF法和MS/MS法相比，LC-MS/MS在質譜分析前加了液相色譜的分離，使得蛋白分析精度更高，對肽段序列測定幾乎可以的達到100％的準確度。因此，與單個蛋白質膠帶的鑑定相比，這項服務的可以鑑定的蛋白數量也更多。LC-MS/MS可以用於鑑定200個蛋白質左右的蛋白混合物樣品，包括免疫沉澱樣品，Pull-down樣品等。

圖3。 三種蛋白質鑑定法比對