使用Victor NIVO多模式酶標儀進行快速Ca2+訊號檢測

G蛋白偶聯受體（GPCR）參與許多細胞訊號轉導通路。

目前，超過45%的藥物都以GPCR為靶點。確定GPCR細胞活性，可以透過監測細胞內Ca2+濃度的變化來實現。Ca2+直接或間接調節包括基因表達、細胞運動和收縮在內的許多生理過程。諸如蛋白激酶C（PKC）、轉錄因子NFAT或鈣調磷酸酶等多種蛋白質均受Ca2+濃度變化的調節。在此，我們介紹了使用

VICTOR Nivo多模式讀板儀

以水母發光蛋白生物發光檢測方法，分析在GPCR刺激或抑制下的快速胞內Ca2+訊號。

化學發光法檢測原理是基於GPCR的啟用引起細胞質Ca2+濃度增加

：當GPCR被激動劑啟用後，Gαq亞基從G蛋白解離並誘導肌醇三磷酸濃度增加；從而引起鈣從內質網流入。該檢測採用穩定表達人組胺H1 GPCR和水母發光蛋白的CHO細胞系進行。已知的激動劑和拮抗劑用於受體刺激。檢測中，細胞與腔腸素-h一起孵育。腔腸素-h穿透細胞膜並在氧氣存在下與高表達的水母發光蛋白結合，導致後者重組。在三個Ca2+離子的作用下，水母發光蛋白分子將腔腸素-h底物氧化為腔腸醯胺，釋放二氧化碳並在469nm處產生具有峰值的閃光，透過VICTOR Nivo檢測。

由於GPCR啟用後細胞內Ca2+濃度增加且相應的閃光產生速度非常快，因此該檢測需要極快速的測量響應。

VICTOR Nivo讀板儀

的分液器可以滿足這一需求，它可以在進樣後0。1秒從微孔板底部檢測發光訊號。

結果與討論

陽性化合物Digitonin量效關係

VICTOR Nivo系統

的動力學檢測模式在新增陽性對照Digitonin後精確測量隨時間變化的發光訊號（圖2）。結果表明，Digitonin濃度越低，產生光訊號延遲越長，而最高濃度的Digitonin能最快產生光訊號。這顯示了化合物濃度對Ca2+和訊號產生所需時間的影響VICTOR Nivo對發光訊號曲線的快速動力學測量提高了在不同化合物濃度下化合物效應檢測的準確性，因此能夠精確計算劑量反應曲線。對Digitonin動力學測量中產生的訊號進行整合，並計算曲線下面積的平均值，以生成劑量-反應曲線。

這證實Digitonin能作為水母發光蛋白檢測中的對照品。

細胞數滴定

為了確定H1/水母發光蛋白細胞的檢測視窗，進行了細胞數滴定。不同數量的細胞產生的發光訊號正相關不同的Ca2+濃度。Histamine作為H1受體的標準激動劑。結果表明，當細胞數約80000-100000個/孔時，發光訊號達到飽和。此外，在不同細胞密度下，光訊號的峰值都是同時產生的。

因此，以20000個細胞/孔進行後續實驗。在每孔不同數量的細胞中加入組胺（1。56μM）產生的發光訊號。

使用組胺最佳化激動劑訊號檢測

使用最佳化的細胞數，在H1受體受到組胺刺激後記錄激動劑檢測的動力學測量結果。

使用20000個細胞/孔，在H1受體受到組胺刺激後產生的Ca2+訊號反應的動力學。

與Digitonin類似，研究表明，組胺濃度越低，產生閃光越滯後，而最高濃度的組胺會立即引發光訊號。對H1 GPCR動力學測量中產生的訊號進行整合，並繪製曲線下面積的平均值，以生成劑量-反應曲線。計算得出384孔板實驗條件下組胺的EC50為143。4nM。與先前發表的資料一致。

透過在96孔板格式中重複該實驗，證實了該方法的普適性。108nM組胺的EC50與384孔板實驗中計算的143nM EC50在同一範圍內，表明該方法適用於不同型別的微孔板。

96孔板格式中H1受體刺激後的激動劑檢測。A：在H1受體受到組胺刺激後產生的Ca2+訊號反應的動力學。B：組胺激動劑刺激H1受體後的劑量-反應曲線。

抑制劑訊號檢測

為了證明H1-水母發光蛋白檢測法也可用於受體抑制劑檢測，在激動劑檢測實驗中測定的EC80濃度下，用Triprolidine（曲普利啶）對組胺進行了拮抗劑檢測。繪製曲線下面積的平均值，以生成劑量-反應曲線，計算Triprolidine的IC50為12。28nM。

EC80濃度下透過曲普利啶拮抗劑對組胺激動劑進行檢測的H1受體抑制的劑量-反應曲線。

結論

本研究描述了水母發光蛋白快速發光檢測法的最佳化，以檢測激動劑和拮抗劑對Ca2+偶聯的組胺H1 GPCR的影響。該方法的標準偏差低，板間差異性小，再現性良好。VICTOR Nivo多模式讀板儀與分液器結合非常適用於這類檢測。使用預先設定的方案，利用孔內訊號發生動力學測量和板底部快速訊號檢測，結合VICTOR Nivo的分液器，為該檢測提供了靈活性。

參考文獻

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