運用轉錄組學+蛋白組學研究白菜型冬油菜低溫脅迫機制

前言

2021年12月

歐易/鹿明生物合作客戶

甘肅農業大學

孫萬倉

教授課題組在

Scientific Reports

期刊發表的題為

“iTRAQ-Based Quantitative Proteome Analysis Insights into Cold Stress of Winter Turnip Rapa (Brassica rapa L.) Grown in the Field ”

的研究成果，透過

iTRAQ標記蛋白組學+轉錄組學

研究方法，探究了莖尖分生組織的形態對冬油菜低溫耐受性中的作用。

中文標題：

iTRAQ標記蛋白質組學分析揭示了低溫脅迫對田間生長冬油菜的影響

研究物件：

白菜型冬油菜

發表期刊：

Scientific Reports

影響因子：

4。17

發表時間：

2021年12月6日

合作單位：

甘肅農業大學

運用生物技術：

iTRAQ標記蛋白組學

(由鹿明生物提供技術支援)、

轉錄組學

研究背景

白菜型冬油菜（Brassica rapa L。）作為一種油料作物，可在中國北方寒冷乾旱地區的冬季生存。因此，它在農業生產中具有顯著的生態效益和經濟效益。然而中國北方的極低溫度影響了其種植區域的分佈和產量。高通量測序技術已成功鑑定了白菜型冬油菜和葉中參與冷應激反應性的miRNAs、差異表達基因（DEGs）和差異積累蛋白（DAPs）。此外，研究發現低溫敏感的白菜型冬油菜莖尖分生組織 （SAM） 形態突出，這使它們容易受到環境波動的影響，從而不能越冬。相反，耐寒白菜型冬油菜的SAM降低，抗寒性較強。這表明 SAM 在調控植物耐寒性方面的具有重要作用。

研究思路

研究內容

1. 研究材料

耐凍型Longyou 7和冷敏感型Lenox為材料

2. 研究方法

2。1形態學和生理學分析

2。2蛋白提取，蛋白質消化

2。3

iTRAQ標記結合LC-MS質譜分析

：識別和定量細胞代謝變化

2。5統計分析：單因素方差分析（one-way ANOVA）分析，Duncan ‘s多重比較檢驗

2。6 RNA提取及基因表達qPCR分析

研究結果

生理發育和耐寒性

透過觀察低溫脅迫下Longyou 7和Lenox苗期植株的形態和生理差異發現，Longyou 7的葉柄和葉片幾乎匍匐生長，而 Lenox 的葉柄和葉片直立生長（圖1A）。之後測定了野外不同生長階段SAM水平的高度。與首次取樣（CK） 相比， Longyou 7和Lenox的SAM 的高度增加，且地表水平均高度的Lenox顯著高於Longyou 7（圖1B）。與L7 d和Le CK相比，L7 CK和Le CK樣品的SOD、POD活性和可溶性蛋白含量均顯著降低。L7和Le CK組MDA含量顯著增加。冰凍處理（0℃和-11℃）下，Le CK和Le d的MDA水平顯著高於L7 CK和L7 d，Le CK和Le d的其他生理指標均低於L7 CK和L7 d（圖1C）。這些結果表明，與Lenox相比，Longyou 7的SAM更小，但耐寒性更高。在從田間試驗中發現Longyou 7等抗寒性強的品種的 SAM 較小，在土壤表面以下 5-10 釐米。因此，SAM位於溫度相對穩定的遮蔽潮溼土壤中。

這些結果表明幼苗SAM與耐寒性之間存在關聯。

圖1 | （A） Longyou 7和Lenox的生長特性。（B）Longyou 7和Lenox的SAM和項圈形態。（C） Longyou 7和Lenox越冬後的生理指標。大寫表示有顯著性差異（p<0。01）。數值為3個生物重複的平均值和SD值，均由3個技術重複的平均值計算。

iTRAQ標記蛋白組學分析

透過田間試驗，研究了Longyou 7和Lenox低溫馴化過程中的蛋白質組學變化。以iTRAQ為基礎對Longyou 7和Lenox進行蛋白質組定量分析。共鑑定出6328個蛋白（補充表S1）。

iTRAQ定量鑑定的DAPs

實驗發現當FC>1。5 （p<0。05），DAPs累積增加，FC<0。8 （p<0。05）時，DAPs累積減少。在Le d /Le CK和L7 d /L7 CK之間有76個DAPs，在L7 d /Le d和L7 CK /Le CK之間有48個DAPs （圖2A和2B）。其中L7 d /L7 CK有35個DAPs。這與3個生物重複的主成分分析（PCA）結果一致，說明每個樣品的3個生物重複具有良好的重複性，L7 d /L7 CK和Le d /Le CK差異很大（圖2C）。如圖2D所示，L7 d /L7 CK中表達了111個DAPs，其中57個DAPs上調，54個DAPs下調（補充表S2）。L7 CK /Le CK共表達98個DAPs，其中29個DAPs上調，69個DAPs下調（補充表S3）。Le d /Le CK表達了183個DAPs，其中80個DAPs上調，103個DAPs下調（補充表S4）。在L7 d /Le d有107個DAPs表達，其中28個DAPs累積增加，79個DAPs累積減少（補充表S5）。

圖2 | （A） iTRAQ鑑定的L7 d / L7 CK與Le d / Le CK之間的DAPs Venn圖。（B）不同L7 d / Le d和L7 CK/ Le CK之間用iTRAQ鑑定的DAPs Venn圖。（C）低溫脅迫和凍害下冬油菜的3個生物重複蛋白質組的主成分分析圖。（D）不同對照組的上下調蛋白數。

低溫響應DAPs的分類

透過UniProt-GOA資料庫和基因本體論（GO）註釋對DAPs的功能進行了註釋。在本研究中，GO註釋到了2669個已知蛋白質。根據GO分析結果對DAPs進行細胞成分、生物過程和分子功能的劃分（補充表S6）。如圖3所示，與Le d /Le CK相比，L7 d /L7 CK在前10個生物過程中對苯丙素和澱粉分解過程的響應是唯一的。L7 d /L7 CK在前10個生物過程中對蔗糖、半胱氨酸型內肽酶活性的負調控、磷酸烯醇式丙酮酸轉運、光合作用調控和磷酸丙糖跨膜轉運的響應是唯一的。並且L7 d /L7 CK中澱粉分解過程均下調。

圖3 | （A） L7 d /L7 CK下調DAPs的GO富集分析。（B） L7 d /L7 CK中DAPs上調的GO富集分析。

為了進一步表徵DAPs的功能，作者還進行了KEGG分析。KEGG富集分析顯示了L7 d /Le d之間DAPs的表達途徑，L7 d /Le d上調的DAPs在谷胱甘肽代謝、硫醇代謝、澱粉和蔗糖代謝、酪氨酸代謝、脂肪酸降解、脂肪酸降解、澱粉和蔗糖代謝、酪氨酸代謝和脂肪酸降解中富集。糖酵解/糖異生、氧化磷酸化、苯丙素生物合成和內質網中的蛋白質加工。L7 d / Le d中41個下調的DAPs主要是富含谷胱甘肽代謝，亞油酸的新陳代謝，亞麻酸，磷酸戊糖途徑等。

L7 d /L7 CK與Le d /L e CK相比，L7 d /L7 CK前20位的上調富集具有特殊型組氨酸代謝、轉換型戊糖和葡萄糖醛酸、代謝型嘧啶、代謝型甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸、代謝型丙酮酸和RNA降解型。L7 d /L7 CK對下調富集前20的花生四烯酸代謝具有特異性（圖4）。

圖4 | （A） L7 d / L7 CK中下調的DAPs的Kyoto Encyclopedia of Genes和KEGG通路富集分析。（B） L7 d / L7 CK中上調的KEGG通路富集分析。

目標DAPs的qRT-PCR表達分析

利用qRT-PCR檢測了轉錄產物的表達水平（圖5）。本文隨機選取17個基因來驗證翻譯水平資料的可靠性。在2個品種中這17個基因表現出與蛋白水平幾乎相似的表達模式，僅MLP 328和ERD10的丰度與之相反，這可能是由於各種翻譯後修飾所導致的。

圖5 | DAPs相關基因的RT-qPCR分析。透過2ΔΔCT的方法歸一化靶基因與β-肌動蛋白轉錄本的週期閾值差異，計算轉錄本丰度。

研究討論

本研究透過生理和蛋白質組學分析在冬油菜中鑑定了大量的冷脅迫響應蛋白。探討了冬油菜耐凍性增強的機理和低溫脅迫對冬油菜形態和生理生化變化的影響。文章以耐凍型Longyou 7和冷敏感型Lenox為材料，透過

iTRAQ標記蛋白組學和轉錄組學分析

，揭示了谷胱甘肽轉移酶活性、碳水化合物結合和谷胱甘肽結合、代謝過程及IAA反應與冷應激反應密切相關，鑑定出了Longyou 7和Lenox之間的DAPs，這些DAPs參與氨基酸、碳水化合物、脂質和能量代謝，對提高冬油菜的耐凍性發揮了重要作用。

小鹿推薦

冷脅迫響應蛋白在植物適應低溫環境中發揮著重要作用。文章作者透過iTRAQ標記蛋白組分析對冬油菜耐冷脅迫的分子機制進行了研究。研究結果表明，

DAPs參與氨基酸、碳水化合物、脂質和能量代謝

，這表明DAPs極大地改變了植物的耐凍性。這些發現加深了我們對抗凍分子機制的認識，有助於培育抗寒脅迫品種。此項研究體現了組學技術在機制研究中的重要作用。

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本文系鹿明生物原創